卵巢上皮癌组织中circFNDC3B与miR-99a的表达

闫亚楠 高淑凤 潘树滨

华北理工大学 河北唐山 063210；①唐山市妇幼保健院；②中国医科大学附属第一医院

卵巢癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤[1]，目前主要采用手术、化疗及放疗等治疗方法提高了5年生存率[2]。由于卵巢癌的诊断缺乏明确的肿瘤标志物，其诊断和治疗于临床仍是巨大的挑战。因此，探索关于卵巢癌新的诊断及预后标记物和治疗靶点非常重要。环状 RNA(circular RNA，circRNA)是一种广泛存在人体内的不具有 5'端帽子和 3'端尾巴的共价闭合环状非编码 RNA，较线性 RNA 具有更好的稳定性、敏感性和组织特异性，在正常及肿瘤组织中的表达具有显著差异，其特殊的分子生物学功能尤其是微小RNA(microRNA，miRNA)分子海绵作用，使其具有成为新的肿瘤标志物和分子靶向治疗靶点的可能[3]。目前国内外文献尚未见关于circFNDC3B在卵巢上皮癌中的表达及其作用机制的研究。既往研究表明，circFNDC3B可通过JAK1/STAT3和MEK/ERK信号通路靶向调控miR-99a在肾癌中发挥作用[4]，但迄今为止尚无二者在卵巢上皮癌中的表达及其相关性的研究。本研究拟检测circFNDC3B、 miR-99a在卵巢上皮癌组织中的表达并分析其相关性，为进一步研究卵巢上皮癌的发生发展机制提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2019年8月～2020年8月于唐山工人医院妇产科就诊、临床病例资料完整、接受手术治疗且术后经过病理组织学检查确诊为卵巢上皮癌的患者42例(卵巢上皮癌组)，年龄34～78岁,平均(58.26±11.37)岁；其中浆液性卵巢上皮癌23例、非浆液性卵巢上皮癌19例；卵巢肿瘤直径>5cm 28例，≤5cm 14例；血清糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)>200U/mL 27例，≤200U/mL 15例；根据国际妇产科协会(FIGO)手术病理分期标准:Ⅰ/Ⅱ期18例、Ⅲ/Ⅳ期24例；组织学类型：浆液性癌17例、非浆液性癌25例；病理分级：高分化21例、中低分化21例；有淋巴结转移27例，无淋巴结转移15例；有腹膜转移25例，无腹膜转移17例；有腹腔积液26例，无腹腔积液16例。另外选择同期手术治疗后经病理证实的良性卵巢上皮肿瘤30例(良性肿瘤组)和正常卵巢组织30例(正常卵巢组)为对照，年龄分别为(55.73±13.09)岁、(50.07±8.97)岁。三组患者年龄差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其他治疗，于术中取下新鲜组织标本后立即放入液氮中冷冻并在-80℃下保存。本研究经唐山工人医院伦理委员会批准。所有参与者均签署知情同意书。

1.2试剂和方法

1.2.1主要试剂 Trizol(Cat# 15596-026)购自美国Invitrogen公司，氯仿、异丙醇、无水乙醇购自天津市永大化学试剂有限公司，DEPC水购自北京索莱宝科技有限公司，TIANScript RT KIT(Cat# KR104-02)、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(Cat# FP205)购自天根生物科技(北京)有限公司。

1.2.2实时荧光定量反转录聚合酶链反应(PCR)检测 根据TRIzol试剂盒说明进行操作，提取卵巢组织中的总RNA，经紫外分光光度计对总RNA浓度和纯度进行检测合格后，按照反转录试剂盒TIANScript RT KIT说明书进行反转。采用SYBR green试剂盒进行实时PCR分析，检测circFNDC3B及miR-99a的表达。反应条件为: 95℃预变性15min，95℃变性10s，58℃复性30s，72℃延伸30s，共40个循环。以GAPDH作为内参采用2-△△CT法计算circFNDC3B的相对表达量，以U6作为内参采用2-△△CT法进行miR-99a的相对定量分析。以上实验均重复3次，取平均值。

2 结果

2.1三组患者卵巢组织中circFNDC3B、miR-99a表达情况 将三组患者卵巢组织中circFNDC3B及miR-99a的表达进行两两比较，发现卵巢上皮癌组中circFNDC3B及miR-99a的表达较其他两组均降低；各组间circFNDC3B及miR-99a的表达水平差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组卵巢组织中circFNDC3B、miR-99a的表达比较

2.2circFNDC3B、miR-99a表达与卵巢上皮癌临床病理特征的关系 将42例卵巢上皮癌患者卵巢组织中circFNDC3B、miR-99a表达量以平均值作为截止值，分为circFNDC3B、 miR-99a高表达组和低表达组。进一步探究其与卵巢上皮癌临床病理特征之间的关系，结果表明circFNDC3B的表达与CA-125(P=0.038)、淋巴结转移(P=0.038)、腹膜转移(P=0.037)、FIGO分期(P=0.016)和病理分化(P=0.030)显著相关，但与患者年龄、肿瘤直径大小、组织学类型、有无腹腔积液无关(P>0.05)。miR-99a的表达与CA-125(P=0.000)、淋巴结转移(P=0.001)、腹膜转移(P=0.002)、FIGO分期(P=0.001)、病理分化(P=0.012)和腹腔积液(P=0.000)显著相关，但与患者年龄、肿瘤直径大小、组织学类型无关(P>0.05)。见表2。

表2 42例卵巢上皮癌患者 circFNDC3B、 miR-99a的表达与临床病理特征的关系(例)

2.3卵巢上皮癌组织中circFNDC3B与miR-99a表达的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，circFNDC3B与miR-99a在卵巢上皮癌组织中的表达呈正相关(r=0.923，P<0.001)，见图1。

图1 卵巢上皮癌组织中circFNDC3B和miR-99a表达的相关性

3 讨论

卵巢癌是一种严重威胁女性健康的肿瘤, 其发病率在妇科肿瘤中排名第三[5]；因其早期症状隐匿，且缺乏有效的筛查及诊断方法，约70%的卵巢癌患者确诊时已处于浸润转移的晚期。卵巢癌治疗比较复杂，预后较差[2]，其发病机制仍未完全阐明。

非编码RNA在肿瘤的发生和发展中具有十分重要的作用。近年来随着生物信息学和RNA测序技术的不断更新及发展， circRNA作为非编码RNA家族的新成员被更多的研究者关注，特殊的环状结构使其具有较高的稳定性。研究者还发现circRNA广泛存在于真核生物的细胞内，并且其表达具有细胞特异性、组织特异性和发育阶段特异性等[6]。circRNAs通过多种机制发挥着其生物学作用，包括作为海绵与miRNAs相互作用，作为RNA结合蛋白的调节者调节基因表达及基因转录，并转化为功能性蛋白质或肽[5-7]。越来越多的研究表明，circRNAs可能是一种潜在的肿瘤生物标志物，多种circRNA分子在多种癌症中存在差异表达。circFNDC3B属于FN3家族，由FNDC3B剪切形成。目前肿瘤方向circFNDC3B的研究主要集中于胃癌[8]、肾癌[4]、食管癌[9]、膀胱癌[10]、甲状腺癌[11]等领域。有研究表明circFNDC3B与肾癌预后不良有关，能够显著提高肾癌细胞的迁移能力[12]，研究进一步发现circFNDC3B与miR-99a呈负相关，而且circFNDC3B通过下调miR-99a在肾癌中发挥作用[4]。circFNDC3B可以在胃癌中形成circFNDC3B‐IGF2BP3‐CD44 mRNA的三元复合物，促进CD44的表达，增强胃癌细胞的迁移和侵袭能力[10]。Luo Gang等[9]研究发现circFNDC3B在食管癌组织中高表达，沉默circFNDC3B的表达会抑制食管癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，减弱其迁移和侵袭能力。circFNDC3B在膀胱癌组织中的表达显著下调，并且与病理分期、分级、淋巴侵犯和患者的总存活率有关。在体外和体内，过表达circFNDC3B均可以显著抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。circFNDC3B可以直接与miR-1178-3p结合，靶向癌基因G3BP2的5'非编码区，并且circFNDC3B可以作为miR-1178-3p海绵抑制G3BP2的表达，进而抑制下游的SRC/FAK信号通路，影响膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭[10]。Wu Guojun等[11]通过研究发现circFNDC3B可以通过miR-1178/TLR4调控乳头状甲状腺癌的进展。

本研究利用实时定量PCR技术检测了正常卵巢组、良性肿瘤组及卵巢上皮癌组患者卵巢组织中circFNDC3B的表达，证实了circFNDC3B在卵巢上皮癌组织中呈现表达降低的趋势，且其表达量与CA-125、有无淋巴结转移、有无腹膜转移、FIGO分期和病理分化显著相关，但与患者年龄、肿瘤直径大小、组织学类型、有无腹腔积液无关。

mir-99a 位于21q21，在肿瘤的发生及侵袭转移中发挥重要的调控作用，目前已被发现在多种肿瘤中呈异常表达[13-18]。现有研究表明circFNDC3B与miR-99a在心肌再生修复[19]和肿瘤领域有密切关系。目前肿瘤方向circFNDC3B的研究主要集中于膀胱癌[4]领域，尚无关于circFNDC3B与miR-99a在卵巢癌中的研究。本实验通过实时定量 PCR技术检测发现，miR-99a在卵巢上皮癌患者的卵巢中组织中呈低表达，并且其表达量与CA-125、有无淋巴结转移、有无腹膜转移、FIGO分期、病理分化和有无腹腔积液显著相关，与患者年龄、肿瘤直径大小、组织学类型无关。另外，本研究亦发现 circFNDC3B与miR-99a呈正相关，由此推测在卵巢上皮癌中circFNDC3B可能调控miR-99a的表达。

综上所述，本实验通过检测卵巢上皮癌患者卵巢组织中circFNDC3B与miR-99a的表达，证实二者的表达呈降低趋势，且与各种临床病理特征具有重要的关系；另外，本研究发现 circFNDC3B与miR-99a的表达呈正相关，由此推测circFNDC3B可能调控miR-99a的表达，在卵巢上皮癌的发病机制中起着一定的作用。