五加生化胶囊指纹图谱研究

任晓蕾，线金珠，何 翔，左文丽，关贵彬，霍金海

(1黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036；2多多药业有限公司·黑龙江 佳木斯 154007)

五加生化胶囊为2020版《中国药典》收载独家品种[1]，由川芎、当归、干姜、桃仁、刺五加浸膏、甘草6味中药组成，具有益气养血、活血祛瘀，适用于经期及人流术后产后气虚血瘀，小腹疼痛按之不减，腰背酸痛、心悸气短等症[2-5]。目前该品种质量标准仅对刺五加浸膏中成分建立含量测定方法，为单一药材指标性成分定量方法，具有一定片面性。中药质量控制需针对其组分及组分中的各有效成分含量的合理配比做进一步研究，中药指纹图谱能反映中药可测成分的整体质量信息， 整体评价产品质量的稳定性和一致性[6-10]。本文采用HPLC法建立五加生化胶囊指纹图谱，以溯源的方式对五加生化胶囊质量进行严格把控。

1 材料

1.1 试药 五加生化胶囊：多多药业有限公司，批号：1812231、1904221、1905121、1906151、1906291、1905101、1905061、1907061、1812261、1908101]。绿原酸(110753-201817)、刺五加苷E(C-008-160606)、异嗪皮啶(Y-027-170328)、紫丁香苷(111574-200603)、甘草酸单铵盐(110731-201619)、藁本内酯(RFS-G01001909016)、原儿茶酸(Y-031-140801)、川芎嗪(RFS-C04511812016)：成都彼斯特生物科技有限公司。甲醇(色谱纯)：Dikma公司；磷酸(色谱纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；KQ-300DB数控超声仪：昆山市超声仪器有限公司；BP211D 型电子天平：德国Sartorius公司；BSAZ24S-CW型电子天平：赛多利斯； ATC2-5-U 超纯水机：美国艾科浦国际有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸；洗脱梯度(0～18 min，7%～27%A；18～22 min，27%A；22～26 min，27%～28%A；26～29 min，28%～31%A；29～33 min，31%～36%A；33～37 min，36%～42%A；37～45 min，42%～52%A；45～52 min，52%～73%A；52～65 min，73%～76%A；)；检测波长：230 nm；体积流量：0.8 mL/min；柱温：35 ℃；进样量10μL。

2.2 对照品溶液制备 分别取绿原酸、刺五加苷E、紫丁香苷、甘草酸单铵盐、藁本内酯、原儿茶酸及洋川芎内酯I，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取五加生化胶囊内容物1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取同一供试品溶液(批号：1812231)，在“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。以11号峰(紫丁香苷)为参照峰，结果各共有色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD分别小于1%及2%，仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验 取同一批五加生化胶囊样品(批号：1812231)，按“2.1”项下供试品制备方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”色谱条件进样测定，以11号峰(紫丁香苷)为参照峰，6 份供试品溶液中药指纹图谱共有峰的相对保留时间RSD值小于1%，相对峰面积RSD值小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验 取同一份“2.3”项下五加生化胶囊供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，供试品溶液制备完成后第0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图。以11号峰(紫丁香苷)为参照峰，供试品溶液在制备后24 h内指纹图谱峰相对保留时间RSD值小于1%，相对峰面积RSD值小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立 取10批五加生化胶囊，按“2.1”项下色谱条件进行测定，采用国家药典委员会《中药色谱特征图谱相似度评价系统》2012年版，对10批样品进行图谱分析和相似度评价，采用平均数法，多点校正后经全谱峰匹配，自动匹配生成对照图谱R，计算相似度。得到五加生化胶囊HPLC指纹图谱共有色谱峰24个，其中峰4、10、11、14、16、20、21、24分别与原儿茶酸、绿原酸、紫丁香苷、刺五加苷E、洋川芎内脂I、洋川芎内脂A、藁本内脂、甘草酸单铵盐对照品峰的保留时间相对应，且紫外光谱图一致，混合对照品色谱图与五加生化胶囊样品图见图1，以11号峰(紫丁香苷)为特征峰，相似度评价结果见表1、图2，10批样品的相似度在0.885～0.951之间，仅1批相似度小于0.9，说明10批样品相似度差异较小。

表1 10批样品相似度

图1 共有峰色谱图(4.原儿茶酸；10.绿原酸；11.紫丁香苷；14.刺五加苷E；16.洋川芎内脂I；21.藁本内脂；24.甘草酸单铵盐)

图2 10批五加生化胶囊HPLC指纹图谱

对五加生化胶囊样品与单味药进行比较分析，1号峰归属于干姜，3、4、6、7、9、13、17号峰归属于刺五加，18、24号峰归属于甘草，19～23号峰归属于川芎， 2号峰来自于刺五加和川芎，5、12、16号峰来自于刺五加和当归，8号峰由刺五加、当归、川芎和桃仁共同提供，10号峰来自于刺五加、当归、川芎和甘草，11号峰来自于刺五加和桃仁，15号峰来自于当归和川芎。

3 讨论

3.1 提取溶剂考察 采用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇、乙醇进行样品提取，分析图谱可见复方中成分可在50%甲醇提取液中得到较好的体现，出峰数目较其他提取溶剂多，因此选择50%甲醇作为供试品制备的提取溶剂。

3.2 流动相的选择及波长考察 通过考察0.1%甲酸-甲醇、0.1%醋酸-甲醇、0.1%磷酸-甲醇、0.1%磷酸-乙腈等流动相，甲醇水系统表现出样品的峰貌，但对于多数有机酸类成分需要在一定的酸性条件下促进样品中成分的游离，达到分离检出的目的，本系统使用磷酸作为水相，在0.1%浓度下既能达到最佳分离效果，故流动相为甲醇-0.1%磷酸梯度洗脱。

鉴于样品制备工艺，分析五加生化胶囊供试品中主要含有苷类、皂苷、有机酸等易溶于水的成分，此类成分紫外吸收较弱，为将其成分全貌较好的表现出来，故选用短波长处进行观察，预实验中波长考察同样发现当吸收波长大于270 nm时，峰数明显减少。

3.3 流速、柱温选择 分别考察流速0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min下色谱出峰情况，流速0.8 mL/min时色谱峰峰形适中，分离度好，色谱峰的数目多；因此选择本研究流速为0.8 mL/min。考察柱温20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃下色谱出峰情况，柱温35 ℃时色谱峰峰形适中，分离度好，峰个数多，因此选择35 ℃为柱温。

本研究采用HPLC法建立五加生化胶囊的指纹图谱，方法简单、快捷，能全面反映五加生化胶囊的质量，为全面控制其质量提供了重要参考依据。