增乳口服液中黄芪甲苷含量的HPLC测定及提取工艺优化

朱 琳, 陆新花, 薛 豪

(杭州胡庆余堂药业有限公司·浙江 杭州 311100)

增乳口服液由党参、黄芪、当归、熟地黄、王不留行、桔梗6味药材提取加工而成，具有益气、养血、增乳的功效，用于产后缺乳、少乳[1]。增乳口服液质量标准中黄芪甲苷的含量测定方法为薄层色谱扫描法，由于薄层色谱扫描法误差较大且操作繁琐，所以本实验先建立用HPLC测定增乳口服液中黄芪甲苷含量的方法，通过评价正交试验设计中黄芪甲苷的含量指标，优选增乳口服液的最佳提取工艺参数，为该制剂在工业生产提供实验依据。

1 仪器与试药

Agilentll00型高效液相色谱仪。黄芪甲苷对照品：中国食品药品检定研究院，批号110781-201616，含量测定用；增乳口服液：杭州胡庆余堂药业有限公司。

2 方法

2.1 增乳口服液中黄芪甲苷的HPLC测定

2.1.1 对照品溶液制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含黄芪甲苷0.5 g/L的对照品溶液[2]。

2.1.2 供试品溶液制备 精密移取10 mL样品，加水饱和正丁醇振摇提取5次(30、30、20、20、20 mL)，合并正丁醇液[1]，用2% 氢氧化钠溶液充分洗涤2 次，每次50 mL，弃去碱液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解[2]，移至5 mL量瓶中，摇匀用滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 色谱条件 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈∶水(32∶68)；用蒸发光散射检测器。

2.1.4 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、供试品溶液各20μL注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。色谱图中保留时间(约8 min)处有吸收峰，专属性良好，见图1。

图1 黄芪甲苷HPLC色谱图(1.黄芪甲苷)

2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、2、5、10、15、20、25、30μL按“2.1.4”色谱条件进行测定，以峰面积积分值的常用对数为纵坐标、黄芪甲苷量的常用对数为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。计算得回归方程Y=1.24046X+2.8918(r=0.9995)，表明黄芪甲苷在0.504～15.108 g/L范围内线性关系良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，在放置0、1、2、4、8、12 h后精密吸取20μL进样，测定峰面积值，计算得出峰面积积分值的RSD为1.20%；表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.1.7 精密度试验 取对照品溶液重复进样6次，按“2.1.3”色谱条件测定黄芪甲苷的峰面积，计算得出峰面积积分值的RSD为1.04%；表明在此实验条件下精密度良好。

2.1.8 重复性试验 取同一个批号样品，按“2.1.2”方法制备6 份供试品溶液，分别测定峰面积，计算含量的RSD为1.01%；表明该方法具有较好的重复性。

2.1.9 加样回收试验 取已知含量(黄芪甲苷0.15 g/L)的同一批样品，精密移取10 mL，加入对照品约1.5 mg，按“2.1.2”制备加标样供试液。精密吸取加标样供试液20μL，按上述测定方法测定其峰面积，计算回收率和RSD。结果见表1。

表1 增乳口服液中黄芪甲苷的加样回收试验结果

2.1.10 样品含量测定 按上述方法测定了5批样品中黄芪甲苷的含量，结果见表2

表2 增乳口服液中黄芪甲苷的含量

2.2 增乳口服液工艺优化

2.2.1 单因素试验考察[3-4]通过4个因素(加水量、煎煮温度、煎煮时间及煎煮次数)进行试验分析，再进行正交实验设计。

2.2.1.1 加水量对制剂中黄芪甲苷含量的影响 称取增乳口服液5份，每份分别设定加水量为3、5、8、10、12 倍量，煎煮1次1 h，合并煎液过滤，按“2.1.2”方法制备成供试品溶液，在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定，考察加水量对黄芪甲苷的含量影响，结果见图1。由图可见，随着加水量的增加，黄芪甲苷的含量也有所提高；在5、8、10倍量的加水量时，黄芪甲苷的含量值较高并趋向稳定。因此，选取5、8、10倍量的加水量作为3个水平进行正交实验。

图1 加水量对黄芪甲苷的含量影响

2.2.1.2 煎煮温度对制剂中黄芪甲苷含量的影响 称取增乳口服液5份，每份分别设定煎煮温度为80、85、90、95、100 ℃，加8倍水量，煎煮1次1 h，合并煎液过滤，按“2.1.2”方法制备成供试品溶液，在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定，考察煎煮温度对黄芪甲苷的含量影响，结果见图2。由图可见，随着煎煮温度的提高，黄芪甲苷的含量也有所提高。在90、95、100 ℃时，黄芪甲苷的含量值较高并趋向稳定。因此，选取90、95、100 ℃作为3个水平进行正交实验。

图2 煎煮温度对黄芪甲苷的含量影响

2.2.1.3 煎煮时间对制剂中黄芪甲苷含量的影响 称取增乳口服液5份，每份分别设定煎煮时间为30、60、90、120、150 min，加8倍水量，煎煮1次，合并煎液过滤，按“2.1.2”方法制备成供试品溶液，在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定，考察煎煮时间对黄芪甲苷的含量影响，结果见图3。由图3可见，随着煎煮时间的延长，黄芪甲苷的含量变化不大，推测煎煮时间过长会将其他药材中的非有效成分煎出，导致提取液过稠，影响黄芪甲苷的含量检测，同时在工业生产中煎煮时间过长也不利于生产效率，因此，煎煮时间选取为1 h，不再进行正交实验。

图3 煎煮时间对黄芪甲苷的含量影响

2.2.1.4 煎煮次数对制剂中黄芪甲苷含量的影响 称取增乳口服液5份，每份分别设定煎煮次数为1、2、3、4、5，加8倍水量，煎煮1 h，合并煎液过滤，按“2.1.2”方法制备成供试品溶液，在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定，考察煎煮次数对黄芪甲苷的含量影响，结果见图4。由图4可见，随着煎煮次数的增多，黄芪甲苷的含量也有所提高。在1、2、3 次时，黄芪甲苷的含量值较高并趋向稳定，次数再增加时含量变化不大。因此，选取1、2、3 次作为3个水平进行正交实验。

图4 煎煮次数对黄芪甲苷的含量影响

2.2.2 正交试验设计筛选最佳提取工艺

2.2.2.1 正交试验设计 在单因素分析的基础上，以加水量、煎煮温度、煎煮次数作为考察因素，每个因素选择3个水平。供试品溶液的制备按“2.1.2”方法，在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定，以增乳口服液中黄芪甲苷含量作为评价指标，采用L9(34)正交表设计，具体因素水平见表3。

表3 增乳口服液提取工艺正交试验因素水平

2.2.2.2 正交设计试验及结果 见表4～表5。

表4 正交试验设计及结果

表5 方差分析结果

由表4结果中分析各因素对黄芪甲苷含量的影响程度依次为B>C>A，即加水量对指标影响最大，其次为煎煮次数和温度，由表5可知因素B有显著性影响(P<0.05)，其他因素则无显著性影响。综合以上分析，可得提取工艺参数最佳为A3B2C2，即加入8 倍量水100 ℃煎煮2 次为最佳提取工艺。

2.2.3 工艺验证 为验证该工艺的重复性、可行性，进行3次实验。按处方称取6味药材，用正交试验优选的提取工艺参数进行试验，测得黄芪甲苷平均转移率为41.01%，RSD 1.96%。

3 讨论

增乳口服液现行标准是用薄层扫描法测定黄芪甲苷的含量，本实验采用HPLC法测定黄芪甲苷的含量，并进行了方法学验证。结果表明：以峰面积积分值的常用对数(X)对进样量的常用对数(Y)线性回归方程为：Y=1.24046X+2.8918(r=0.9995)，线性范围为0.504～15.108 g/L，回收率为96.52%，RSD为1.47%。同时在供试品溶液制备中，用2%氢氧化钠洗脱来代替大孔吸附树脂柱洗脱，缩短了样品处理时间，并能准确的测定样品中的黄芪甲苷含量，且重复性好，误差小，可用于增乳口服液中黄芪甲苷的含量测定，为提高该制剂质量标准提供实验依据。

本次实验通过单因素分析各个因素对黄芪甲苷含量的影响后，再采用3因素3水平的正交试验设计，经方差分析结果显示加水量B因素有显著性影响(P<0.05)，优选出最佳提取工艺为加入8倍量水100℃煎煮2次。经过3次验证后，测得黄芪甲苷平均转移率为41.01%，RSD 1.96%。结果表明，增加加水量能有效提高制剂中黄芪甲苷的水提取转移率，为增乳口服液提取工艺提供实验数据。