五味子-黄芪不同比例配伍对混合多糖含量及体外抗氧化活性的影响

陈 霞，杨鸽华

(1诸暨市中心医院药剂科·浙江 诸暨 311800；2诸暨市人民医院中药库·浙江 诸暨 311800)

中药配伍用药是祖国医学的特色之一，配伍可通过药性的相合与制约，充分发挥药物之间的相互作用，以增进疗效，扩大治疗范围，同时降低毒性反应[1]。五味子、黄芪是临床常用的配伍药对，五味子是木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”，因其酸、苦、甘、辛、咸五种性味俱全，故名为五味子，是《神农本草经》中记载的上品滋补药材[2]。多糖作为五味子的主要活性成分之一，具有含量高、毒性低等优点，众多研究表明，五味子多糖具有降脂、抗氧化、抗疲劳、调节免疫等多重药理活性，具有较佳的新药开发价值[3-4]。黄芪是豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.Mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，主要活性成分包含皂苷、黄酮和多糖等，研究发现，黄芪多糖具有保肝、降压、抗菌、抗肿瘤、抗氧化应激和增强机体免疫等药理作用[5-7]，其中，因黄芪多糖表现出的明显的抗氧化作用，使黄芪被认为是强大的潜在外源性抗氧化剂[8]，在药物的研究开发与疾病的预防治疗方面，均有重要价值。本研究旨在观察五味子与黄芪不同比例配伍对混合多糖含量的影响，并通过DPPH自由基清除实验研究五味子、黄芪不同比例配伍对混合多糖体外抗氧化活性的影响，以探讨二者不同剂量配伍用药的合理性，并为五味子、黄芪配伍的物质基础研究及药理学研究提供思路和数据参考。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂 五味子药材(批号：190601)，经诸暨市人民医院中药库杨鸽华主任鉴定为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果实；黄芪药材(批号：190401)，经诸暨市人民医院中药库杨鸽华主任鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的干燥根；均购于浙江中医药大学中药饮片有限公司。L-抗坏血酸(批号：113170-1911)：上海经科化学科技有限公司。D-无水葡萄糖标准品(批号：110833-201908)：购于中国食品药品检定研究院；水为双蒸水，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备 UV2800/UV2800S型紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司； BSA224S-CW 电子天平(1/10000)：赛多利斯斯泰帝(上海)贸易有限公司；SKM数显恒温电加热套：上海一恒科学仪器有限公司；FD-2型密封式恒温可调式电加热器：嘉兴市欣欣仪器设备有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；SFG-02.500电热鼓风干燥箱：黄石市恒丰医疗器械有限公司。

1.3 五味子-黄芪混合多糖的提取 取五味子、黄芪混合药材，粉碎后置于圆底烧瓶中，按料液比1∶30加入蒸馏水，电热套加热至85 ℃，连续回流提取3 h，过滤，滤液浓缩至浓稠状，冷却后以95%乙醇醇沉，酒精计测定至乙醇体积分数为80%，4 ℃静置沉淀过夜。将沉淀物4 500 r/min离心10 min，离心半径8 cm，所得沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤2次，真空干燥至恒重，即得五味子-黄芪混合多糖。

1.4 五味子-黄芪混合多糖含量测定方法的建立

1.4.1 对照品溶液的制备 精密称取105℃ 干燥至恒重的D-葡萄糖标准品100.2 mg，置于100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得1.002 g/L的对照品贮备液。

1.4.2 供试品溶液的制备 精密称取五味子、黄芪药材各5 g(1∶1配伍)，按“1.3”项下方法制得五味子-黄芪混合多糖。精密称取混合多糖1.005 g，置于100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品贮备液，后续试验根据需要进行稀释。

1.4.3 标准曲线的绘制 精密吸取“1.4.1”项下对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分别置于10 mL 量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，混匀，另取蒸馏水作为空白对照，各依次加入5%苯酚溶液1.0 mL，混匀，再依次加入98 %浓硫酸5.0 mL，充分混匀后置于60 ℃恒温水浴中放置30 min，取出后冷却至室温，于490 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，计算得回归方程为：A=6.0658C+0.0036，R2=0.9997，可见，葡萄糖浓度(C)与吸光度(A)在0.1 002～1.0 020 g/L范围内呈现良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

1.4.4 换算因子的测定 取“1.4.2”项下制得的五味子-黄芪混合多糖约20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。按“1.4.3”标准曲线项下方法处理并测定吸光度，重复测定3次，取平均值。代入回归方程，计算得出混合多糖溶液的葡萄糖浓度(C)，按下式计算得出换算因子f=1.301。换算因子f=W/(C×D)[W为五味子-黄芪混合多糖的质量(mg)；C为混合多糖溶液的葡萄糖浓度(g/L)；D为混合多糖的稀释倍数]。

1.4.5 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液，按“1.4.3”标准曲线项下方法处理，重复测定吸光度5次，计算得吸光度的RSD值为0.52%，表明，仪器的精密度良好。

1.4.6 重复性实验 精密量取同一批供试品贮备液5份各1 mL，置于10 mL具塞试管中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，按“1.4.3”标准曲线项下方法处理并测定吸光度，计算得多糖含量的RSD值为0.83%，表明，本方法的重复性良好。

1.4.7 稳定性实验 精密量取同一供试品溶液，分别于第0、1、2、3、4、5、6 h按“1.4.3”标准曲线项下方法处理并测定吸光度，计算得吸光度的RSD值为0.79%，表明，该供试品溶液在6 h 内的稳定性良好。

1.4.8 加样回收率实验 取已知含量的同一批五味子-黄芪混合多糖6份各2 mg，精密称定，置于10 mL具塞试管中，分别精密加入“1.4.1”项下对照品贮备液1.5 mL，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，按“1.4.3”标准曲线项下方法处理并测定吸光度，计算得平均加样回收率为99.25%，RSD值为0.92%，见表1。

表1 加样回收率实验结果

1.5 五味子-黄芪不同比例配伍对混合多糖含量的影响 按以下9 个配伍比例(3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)，称取9批五味子、黄芪混合药材，各10 g，按照“1.3”项下方法提取制得五味子-黄芪混合多糖，计算得率。

多糖得率(%)=多糖质量(g)/ 五味子、黄芪混合药材质量(g)×100%

以苯酚-浓硫酸比色法检测多糖含量，按照“1.4.2”项下供试品溶液的制备方法制得不同配伍比例五味子-黄芪混合多糖的供试品溶液，按“1.4.3”标准曲线项下方法处理并测定吸光度，按下式计算不同配伍比例五味子-黄芪混合多糖的含量，每个配伍剂量重复进行3次实验，取平均值。多糖含量(%)= C×D×f / W×100%[W 为五味子-黄芪混合多糖的质量(mg)；C 为混合多糖溶液的葡萄糖浓度(g/L)；D 为混合多糖的稀释倍数；f为换算因子]。

1.6 五味子-黄芪不同比例配伍对体外抗氧化活性的影响 采用DPPH自由基清除实验测定不同配伍比例五味子-黄芪混合多糖的抗氧化活性，精密量取上述9 个配伍比例的五味子-黄芪混合多糖供试品溶液各100 μL，置于5 mL具塞试管中，分别加入200μL新配制的DPPH溶液(以无水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液)，蒸馏水定容后，室温下避光反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度。同时以0.2 g/L的L-抗坏血酸作为阳性对照，同法测定吸光度。按下式计算不同配伍比例五味子-黄芪混合多糖的DPPH自由基清除率，每个配伍剂量重复进行3次实验，取平均值。DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/ A0] ×100% ()A1为供试品溶液 + DPPH溶液的吸光度；A2为供试品溶液 + 无水乙醇的吸光度；A0为无水乙醇+ DPPH溶液的吸光度)。

2 结果

2.1 五味子-黄芪不同比例配伍对混合多糖含量的影响 见表2。五味子-黄芪混合多糖在五味子、黄芪3∶1配伍时得率最高，随着五味子比例降低，黄芪比例升高，多糖得率呈现降低-升高-再降低的趋势，在五味子、黄芪1∶1配伍时达到一个峰值，到五味子、黄芪1∶3配伍时，多糖得率降至最低。五味子-黄芪混合多糖的含量在五味子、黄芪3∶1配伍时最低，随着五味子比例降低，黄芪比例升高，多糖含量呈现升高-降低的趋势，在五味子、黄芪1∶1.5配伍时达到一个峰值。可见，五味子、黄芪药材不同比例配伍后，所提取得到的混合多糖得率和多糖含量均表现出较明显的差异。

表2 不同配伍比例五味子-黄芪混合多糖得率和含量测定结果

2.2 五味子-黄芪不同比例配伍对体外抗氧化活性的影响 见表3。五味子-黄芪混合多糖的DPPH自由基清除率，在五味子、黄芪3∶1和2.5∶1配伍时较高，表现出与L-抗坏血酸效果相当的抗氧化活性，随着五味子比例降低，黄芪比例升高，其DPPH自由基清除率呈现降低-升高-再降低的趋势，在五味子、黄芪1∶1配伍时达到峰值，其次为1∶1.5。可见，五味子、黄芪药材不同比例配伍后，所提取得到的混合多糖在体外抗氧化活性方面，呈现出较明显的差异，其中，在五味子、黄芪1∶1和1∶1.5配伍时，体外抗氧化活性最强。

表3 不同配伍比例五味子-黄芪混合多糖的DPPH自由基清除率

3 讨论

多糖是一种聚合糖高分子碳水化合物，研究发现，大多数中药中提取的多糖成分均具有抗氧化应激作用，一方面可自身清除机体内多余的氧自由基，抑制脂质过氧化产生，一方面可通过提高机体内其他内源性抗氧化酶的活性，修复机体氧化与抗氧化系统失衡，进而对抗氧化应激损伤[9]。五味子是临床常用的滋补性中药。《本草纲目》记载“五味子南产者红，北产者黑，入滋补药，必用北者为良”，可见，滋补用药以北五味子最佳[10]。大量研究表明，从北五味子水提液中分离得到的五味子多糖，除具有抗氧化作用外，还具有调节免疫、延缓衰老、抗肿瘤、抗疲劳等多重生理活性，而这些作用的产生均以抗氧化作用为基础[9]。李珊珊等[11]研究发现，北五味子多糖具有较好的体外抗氧化活性，与DPPH和羟自由基清除活性存在明显的剂量依赖性，且随着多糖浓度的升高而增强。Niu[12]等的研究可见，随着五味子多糖浓度的升高，DPPH 自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率均增加，并呈现出明显的剂量依赖性，其中，DPPH 自由基清除效果与同浓度的VE相当，而羟自由基清除效果略低于同浓度的VC。黄芪多糖是从黄芪药材的干燥根系中提取出的一种水溶性杂多糖，具有抗菌、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等多重生物活性。Xue等[13]研究发现，黄芪多糖可通过降低活性氧含量、丙二醛水平和NF-κB通路活性，升高GSH含量和SOD活性，进而抑制PCV2感染诱导的氧化应激反应。此外，黄芪多糖还可通过ErbB/AKT信号通路提高机体细胞的抗氧化能力和对NO的生物利用度，用以减轻内、外源性因素造成的氧化损伤[14]。

中药配伍用药是中医学的特点之一，不同中药之间的合理配伍应用，不仅能够增强原有疗效，还能够抑制或消除自身的烈性和毒性，而药物之间配伍不合理，则可能使原有功效降低，甚至丧失药效[15]。配伍的关键在于药物不同剂量的搭配，相同药物不同配伍比例的变化，不但会对药效强弱造成影响，还可能改变药物的功效主治。五味子、黄芪在中医临床中是较常用的配伍药对，如《宋·太平惠民和剂局方》中载有人参养荣汤，含五味子和黄芪3∶4配伍，主治肺脾气虚、积劳虚损。《叶氏女科》记载柏子养心汤，方中五味子和黄芪按1∶4比例组成，主治妊娠子烦。2015版《中国药典》[16]中记载成药益气养血口服液中，取黄芪和五味子3∶1比例配伍，功效益气养血，常用于气血不足、体虚乏力的治疗。由上可见，相同药物配伍比例的不同，其功效差异较大。本研究参照2015版《中国药典》[16]建立了五味子-黄芪混合多糖的含量测定方法，并对五味子与黄芪不同比例配伍后提取得到的多糖进行了含量测定，结果可见，五味子与黄芪不同比例配伍能够明显影响其混合多糖的得率和多糖含量；DPPH自由基清除实验结果表明，不同比例配伍所得五味子-黄芪混合多糖的体外抗氧化性活性有着明显差异。该结论从化学成分和药理活性方面进一步验证了中药不同比例配伍的合理性和意义，也为五味子与黄芪药对的临床合理配伍用药提供了依据和数据参考。