SPLUNC1基因在2种绵羊不同组织器官中差异表达分析

李珂儿，李劼，李增强，魏立翔，孙延鸣

(石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000)

天然免疫系统是机体的保护屏障，分为3道基本防线，而其中第一道防线包括皮肤、黏膜，是抵御病原体入侵机体的最重要的一步。分布在气道上皮细胞的短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate，lung nasal epithelial clone 1，SPLUNC1)是一种分泌蛋白，同时是天然免疫第一道防线中的关键蛋白[1]。SPLUNC1属于PLUNC(palate，lung and nasal epithelium clone)家族11个成员之一[2-3]，在培养的人原代气道上皮细胞中，SPLUNC1占上皮组织液总蛋白的十分之一[4]。其有着与杀菌性/通透性增强蛋白(bactericidal/permeabilityincreasing protein，BPI)相似的结构，能够结合脂多糖(LPS)，参与抗微生物和抗肿瘤的免疫过程[5]，并对某类炎症刺激及具有反向调控的作用[6]。Wahlen等[7]用比较蛋白质组学的方法对季节性过敏鼻炎患者的鼻腔冲洗液分析，结果显示，与健康对照组比较，过敏性鼻炎患者先天性免疫蛋白SPLUNC1水平下降，而α1-抗胰蛋白酶水平升高，提示SPLUNC1蛋白可作为上呼吸道症状潜在的生物标志物。本实验室先前证实了绵羊重组SPLUNC1蛋白在体外对绵羊肺炎支原体具有抗菌功能[8]。研究发现，对不同工作环境中具有流行症状的病患进行检测，鼻咽处SPLUNC1基因表达水平较低可能影响先天免疫防御功能[9]。

强冷应激会造成机体免疫应答能力受到抑制。产于极冷阿勒泰地区的阿勒泰羊是新疆的常见优质羊种，它体格肥硕、产肉性能高，抗寒产热能力异于其他羊种，面对冷应激时能迅速触发机体防御机制，维持机体内环境稳态，免受病原微生物的侵袭[10]。萨福克羊原产于德国，是著名的肉用绵羊，自引进中国以来，适应性强，繁殖力高，生长发育快，Good等[11]通过对比萨福克羊及特塞尔纯种羔羊对胃肠道线虫的抵抗情况显示，萨福克羊的自然染虫量更高。此外，在生产养殖中发现，萨福克羊对支原体易感性较强[12]。据此猜测，2种品种的羊在抗病原微生物上产生的差异可能与天然免疫基因SPLUNC1的表达量及定位有关。有研究发现SPLUNC1高表达于人、鼠的气道上皮细胞中[13]，有关SPLUNC1在绵羊各器官组织中的定位分布还未有报道。本试验应用SYBR绝对荧光定量PCR的方法，检测SPLUNC1基因在2种绵羊不同组织器官的差异表达量，为深入揭示该基因的调控机制和生物学功能奠定基础，同时为绵羊抗病选育研究提供资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于新疆省石河子市选取临床健康成年阿勒泰羊5只，多胎萨福克羊5只，颈动脉放血致死后，迅速分别剪取瘤胃、气管、支气管、食管、心脏、脾脏、肺叶处、升结肠处及股内侧皮肤样本，将其置于液氮中低温保存，用于提取总RNA。

1.2 主要试剂

TRIzol(美国Ambion公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；SYBR qPCR Master Mix、DNA Marker(南京诺唯赞生物科技有限公司)；pMD19-T载体、Prme Script RT reagent Kit(日本TaKaRa公司；质粒DNA小量抽提试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 引物合成及模板制备

1.3.1 设计并合成引物

通过GenBank中绵羊SPLUNC1基因的mRNA序列(KP883281)，根据其序列利用DNAMAN、Primer 5设计特异性引物：上游引物:5′-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTAGAAGCCCTGC-CCG-3′；下游引物：5′-GCGGCCGCTCAGACTTTGATGACAAATTCTAGCCC-3′，预计扩增目的基因片段长度为748 bp。引物交由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 样品总RNA提取及反转录

按照TRIzol Reagent试剂盒操作说明分别提取阿勒泰羊及多胎萨福克羊的肺、气管、支气管、食管、心脏、脾脏、结肠及皮肤的总RNA，DEPC处理水溶解，核酸蛋白测定仪NanoDrop One测定总RNA的浓度和纯度，调整浓度至500 ng/μL左右。同时，取5 μL提取样品经琼脂糖凝胶电泳后利用紫外凝胶成像仪分析其完整性。参照Prme Script RT reagent Kit反转录试剂盒说明书将各样品从RNA反转为cDNA，于-80 ℃。反转录产物用于制备绝对定量标准品及定量PCR扩增反应。

1.4 绝对定量标准品的制备

1.4.1 SPLUNC1基因片段的扩增

以反转录产物为模板进行PCR扩增反应，PCR反应体系如下:气管cDNA 4 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，ddH2O219.4 μL，2×TaqPCR MasterMix(含染料)25 μL。PCR扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环;72 ℃延伸10 min。产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 克隆SPLUNC1基因片段并验证

利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物纯化，纯化产物与pMD619-T连接，连接体系为：目的片段4.5 μL，Solution one 5 μL，T载体0.5 μL。在16 ℃条件下过夜连接。第2天将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂至含100 mg/L的氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基中，37 ℃温箱中过夜培养。次日挑取白色阳性单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，振荡培养1 h。对菌液进行PCR初步鉴定，选取阳性菌准备进行质粒提取。

1.4.3 质粒DNA的提取

利用质粒DNA小量抽提试剂盒对鉴定正确的阳性菌液进行质粒提取，用核酸分析仪Nanodrop one测定质粒浓度及纯度，根据公式计算质粒拷贝数，将质粒10倍倍比稀释，选取8个稀释度(10-1～10-8)的质粒作为模板进行荧光定量PCR来建立标准曲线，20 μL荧光定量PCR体系：待测样本cDNA 2 μL，浓度为10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，ddH2O27.2 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变形30 s；循环反应：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s(40个循环)；溶解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以拷贝数的对数值为横坐标，循环数为纵坐标绘制标准曲线。拷贝数计算公式:

质粒拷贝数/(copies·mL-1)=

其中，M. 质粒分子量+插入片段分子量；W. 660 Da/bp

1.5 荧光定量PCR检测SPLUNC1 mRNA的表达

依照1.3.2中反转录体系所得cDNA进行荧光定量PCR，荧光定量反应条件和反应体系参照1.4.3，通过标准曲线线性关系计算得到cDNA的起始拷贝数。每个待测样品各设3个重复，荧光定量反应结束后自动生成扩增曲线、溶解曲线及Ct值。

1.6 数据分析

利用SPSS26.0软件中One-way ANOV分析2组羊9个组织器官(各组织样本量为5份)中SPLUNC1基因mRNA绝对表达量的差异，试验数据结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 总RNA检测

利用Nanodrop One核酸蛋白检测仪测定RNA纯度及浓度，OD260/OD280检测结果在1.9～2.0之间，说明RNA纯度较高，1%琼脂糖凝胶结果18S及28S条带清晰，样品完整性好。各项指标均符合要求，可以进行后续试验。凝胶电泳检测结果见图1。

2.2 绝对定量标准品制备

SPLUNC1基因扩增片段在748 bp附近有条带，与预计长度相符(图2);阳性菌液PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在748 bp左右有较亮的条带，与预期结果相符(图3)。选取阳性菌提取质粒，测阿勒泰羊质粒浓度为140 ng/μL，萨福克羊质粒浓度为131 ng/μL，根据其拷贝数计算公式得出其拷贝数分别为1.71×1014、1.6×1020copies/mL。质粒倍比稀释后进行荧光定量PCR扩增，生成SPLUNC1基因的标准曲线和溶解曲线。阿勒泰羊标准曲线为：y=-3.394 7x+45.532(y：Ct值，x：起始拷贝数)，扩增效率E=97%，回归系数R2=-0.999 0(图4)。萨福克羊标准曲线为y=-3.292 1x+42.776，扩增效率E=101%，回归系数R2=-0.998 9(图5)。结果表明，标准品浓度在10倍梯度稀释后，起始模板浓度与CT值之间具有良好线性关系。溶解曲线(图6、7)峰值单一，PCR产物Tm值相对集中，说明引物具有较好的特异性，PCR过程中无非特异性扩增，扩增产物无二聚体出现。结果表明，本研究建立的标准曲线能够准确反映目的基因片段的扩增。

1～2. 样品总RNA

M. DNA Marker DL2000 Plus；1～4. SPLUNC1基因

M. DNA Marker DL2000 Plus；1～10.阳性菌液

图4 阿勒泰羊SPLUNC1基因荧光定量PCR标准曲线

图5 多胎萨福克羊SPLUNC1基因荧光定量PCR标准曲线

图6 阿勒泰羊SPLUNC1基因标准品荧光定量PCR溶解曲线

图7 多胎萨福克羊SPLUNC1基因标准品荧光定量PCR溶解曲线

2.3 绵羊各组织SPLUNC1基因mRNA表达

根据标准曲线中Ct值与基因拷贝数的关系，换算出SPLUNC1基因在总RNA中的绝对表达量。阿勒泰羊与多胎萨福克羊均为气管中SPLUNC1基因表达量最高，拷贝数均值分别为9.201×106copies/μg(表1)和1.772×105copies/μg(表2)，显著高于其他各组织(P<0.05)。阿勒泰羊各组织中SPLUNC1基因表达量均显著高于多胎萨福克羊(P<0.01)，见图8。

表1 阿勒泰羊各组织中SPLUNC1基因表达×105 copies·μg-1

表2 萨福克羊各组织中SPLUNC1基因表达×104copies·μg-1

注：**差异极显著(P<0.01)

3 讨论

呼吸系统是机体与外界环境接触最密切、最频繁的开放系统[14]。在机体汲取氧气的过程中，空气中的微生物、过敏原、有害气体都能刺激对机体引发各种疾病。存在于呼吸道表面的免疫分子成为保护机体的重要因素。近几年有关SPLUNC1在抗呼吸道感染上的研究方兴未艾[15]。Sayeed等[16]研究发现，体内条件下，SPLUNC1可以抑制铜绿假单胞菌生长。Ahmad等[17]通过对野生型小鼠和SPLUNC1基因敲除型小鼠同时感染伯克霍尔德菌，结果发现SPLUNC1基因缺失的小鼠肺部的细菌负荷增加，说明SPLUNC1蛋白可以减轻呼吸道伯克霍尔德菌感染的负担。以上均能说明SPLUNC1蛋白具有抗菌抗微生物感染的功效。目前有关SPLUNC1基因在绵羊上的定位还未有研究，陶岳等[18]对绵羊的肺脏及其他脏器组织进行支原体分离鉴定发现，绵羊肺炎支原体感染机体后在心脏、肝脏、脾脏等器官内也能分离出病原，说明肺脏不是绵羊肺炎支原体感染的唯一靶器官。周厚德等[19]发现SPLUNC1蛋白在人胚胎的眼和脂肪组织中也存在表达。本文旨在研究该基因在绵羊体内定位，为探究该基因在呼吸器官外的脏器组织中的抗病原微生物及其他功能奠定基础。

SPLUNC1基因的表达量一定程度上间接反映机体的天然免疫水平。为了明确绵羊SPLUNC1表达的特异性，试验运用实时荧光定量PCR的方法构建了绵羊SPLUNC1基因组织表达谱。结果显示，SPLUNC1基因在阿勒泰羊和多胎萨福克羊的9个组织器官中均有表达，其中阿勒泰羊气管表达量是皮肤表达量的377倍，该结果与SPLUNC1基因在人上的分布特点具有相似性[13]。此外，研究结果还显示SPLUNC1在绵羊瘤胃中有微弱的表达量，这在王爽等[20]的研究中得到了印证，他们利用原位杂交的方法对人体37种组织进行细胞学定位发现，胃固有层中的壁细胞中存在SPLUNC1的表达，说明该基因在消化系统胃等器官中存在更深的生物学功能有待探究。SPLUNC1的差异表达揭示了该基因在各器官中可能均发挥一定的功能。

在养羊生产中发现，多胎萨福克羊对绵羊支原体肺炎的感染率远远高于阿勒泰羊(待报道)。这与本研究显示阿勒泰羊的SPLUNC1基因表达量均显著高于多胎萨福克羊的结果相一致。SPLUNC1基因对绵羊抗病力的影响及其在免疫调控上的作用值得进一步研究。