日本脑炎病毒非结构蛋白功能的研究进展

韩超逸，汤德元，廖少山，张森，杨志刚，晏仁潭

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，对人类健康和养殖业造成了巨大威胁。JEV可通过蚊虫为媒介传播，引起人的病毒性脑炎死亡率达25%～30%，50%的存活者会留下永久性的中枢神经系统损伤后遗症；可致母猪流产，产死胎、木乃伊胎，公猪睾丸炎繁殖障碍，仔猪感染JEV死亡率可达100%[1]。目前，JEV并无特效治疗药物，疫苗接种是防控乙脑最有效的手段。

1 JEV基因组结构

JEV为单股正链RNA病毒，基因组全长11kb分为3个部分，分别是5′端和3′端的非编码区(UTR)，以及中间的开放阅读框(ORF)。5′端UTR区长95 nt含有帽子结构，可保护5′端不被核酸酶或磷酸酶降解，促进起始翻译。3′端UTR区长582 nt不具有poly A结构，但含有一段对病毒复制极其重要的保守核苷酸序列。ORF区长10.3 kb，几乎贯穿整个基因组，编码3 500个氨基酸残基的多聚蛋白前体，该多聚蛋白前体在宿主信号肽酶和JEV NS3蛋白的作用下切割为3种结构蛋白：C、PrM、E，以及7种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。

2 JEV非结构蛋白功能

2.1 NS1蛋白

NS1蛋白由352个氨基酸组成，大小为46 kDa，是一种分泌型糖基化蛋白，在黄病毒科中高度保守。NS1蛋白具有3种形态分别位于细胞内不同的位置，单体位于细胞内，二聚体位于细胞内质网和细胞膜，六聚体被分泌到细胞外发挥其主要功能[2]。糖基化的NS1蛋白参与黄病毒粒子的组装和释放，六聚体形态的NS1蛋白与免疫逃避有关[3]。周玉鹏[4]通过将构建的NS1诱饵质粒与人脑组织cDNA文库菌进行杂交筛选互作蛋白，并通过免疫共沉淀试验证实NS1蛋白与宿主蛋白DAZAP2互作，为进一步揭示JEV感染过程中NS1蛋白与宿主蛋白互作机制提供了基础。在黄病毒感染中NS1抗体或抗原是理想的生物诊断标志。Zhou等[5]通过制备NS1多克隆抗体研发了检测NS1抗体的阻断ELISA，该方法有较高的灵敏度及特异性，为临床JEV进行血清学监测以及疫苗接种后的免疫状况评估提供了理想的方法。除此之外，NS1蛋白具有免疫原性，可诱导机体产生中和抗体，并且WNV NS1蛋白与JEV NS1蛋白有部分交叉保护作用[6-7]。纪美静[8]使用原核表达纯化的NS1蛋白间隔两周对小鼠进行腹腔注射，发现原核表达纯化的NS1蛋白可刺激小鼠产生中和抗体，并且免疫效果要略好于E蛋白、M蛋白以及乙脑灭活疫苗及弱毒疫苗，该研究表明原核表达的NS1蛋白同样具有良好的免疫原性，为原核表达大量制备NS1蛋白亚单位疫苗提供了理论支持。

2.2 NS1′蛋白

NS1′蛋白产生原因是由于NS2A基因易发生核糖体移码，导致核糖体在NS1蛋白之后继续翻译，形成了NS1′蛋白[9]。疫苗毒株SA14-14-2 NS2A基因的A66G发生了突变，不会发生核糖体移码，因此不会产生NS1′蛋白，故临床可通过检测NS1′蛋白来区分野毒感染和疫苗接种[10]。范煜[11]建立了检测NS1′蛋白的双抗体夹心ELISA法，该方法可特异性的检测出重组的NS1′蛋白，以及强毒株感染细胞及攻毒小鼠血清中的NS1′蛋白，为临床JEV野毒感染检测提供了理想方法。NS1′蛋白可抑制细胞抗病毒反应，Zhou等[12]研究发现NS1′蛋白可通过上调miR-22抑制MAVS mRNA及蛋白的表达，减少Ⅰ型干扰素的转录和表达，创造出有利于JEV复制的条件，该研究揭示了NS1′蛋白新的生物功能，为JEV抑制细胞天然抗病毒反应机理增添了新的内容。

2.3 NS2A蛋白

NS2A分子量约为17 kDa，为疏水跨膜蛋白参与JEV复制，NS2A 166位氨基酸对JEV的体外增殖和组织嗜性有重要作用，当NS2A蛋白氨基酸发生H166Y突变时，JEV在Neuro-2a细胞中的生长能力变强[13]。NS2A氨基酸位点发生K84A突变可抑制病毒复制，而R171A、K193A、R163A突变可直接导致JEV无法正常复制，对病毒产生致命影响。NS2A具有miR-499-5p的结合位点，miR-499-5p可靶向NS2A蛋白抑制JEV复制[14]。NS2A蛋白具有编码病毒RNAi抑制因子(VSR)功能，可与dsRNA、siRNAs相互作用抑制RNAi天然免疫促进病毒复制，其正氨基酸位点T33I、R98A、R140A与该功能紧密相关[15]。TRIM52蛋白是天然免疫抗病毒反应中重要的参与者，可促进RIG-Ⅰ的泛素化和激活，诱导产生IFN发生抗病毒作用[16]；NS2A可与TRIM25在细胞质中共定位，NS2A可通过TRIM25 RING区与其互作，TRIM52可通过E3连接酶活性以蛋白酶体依赖性方式降解NS2A，抑制JEV感染[17]。

2.4 NS2B蛋白

NS2B为跨膜蛋白约由130个氨基酸组成，分子量为14 kDa。NS2B蛋白的中心亲水区对于NS3蛋白酶激活具有重要作用，NS2B蛋白中心结构域发生突变可影响NS3蛋白酶活性，使病毒复制受限[18]。除此之外NS2B蛋白跨膜区域突变可减少JEV RNA合成和病毒的组装[19]，表明NS2B蛋白跨膜区域对JEV组装有着关键作用。Ma等[20]研究发现信号酶肽复合物1(SPCS1)是JEV复制所必须的宿主因子，SPCS1可与NS2B的N端疏水跨膜结构和C端疏水跨膜结构互作参与病毒组装，为JEV复制机制及JEV药物潜在靶点的研究提供了参考。Fan等[21]研究发现NS2B蛋白氨基酸发生V99L替换可增强JEV复制能力，意味着NS2B蛋发生突变可能与JEV复制能力变化有关。

2.5 NS3蛋白

NS3蛋白分子量大小为72 kDa，具有丝氨酸蛋白酶活性以及RNA解旋酶，核苷酸三磷酸酶活性，可切割病毒蛋白参与JEV复制[22]。袁磊[23]通过构建靶向NS3基因5361～5381位的shRNA质粒，显著降低了JEV mRNA含量93.9%，病毒滴度下降大约950倍，表明NS3基因5361～5381位具有成为JEV药物研发靶点的巨大潜力。NS3蛋白可与热休克蛋白DNAJB6及NS4B蛋白互作，并且二者过表达均会抑制JEV复制[24-25]。Jiang等[26]研究发现NS3蛋白解旋酶区域可与miRNA前体结合，导致前体miRNA错误解链，抑制成熟miRNA生成。NS3蛋白可通过抑制宿主miR-466-3p表达从而促进1L-1β表达以及JEV复制，而当NS3蛋白R226和R202位精氨酸位点发生突变时，对NS3蛋白对miR-466-3p抑制作用消失，该研究表明NS3蛋白不仅参与着JEV的复制，也在JEV所诱导的炎症反应中起着正向调控的作用。

2.6 NS4A蛋白

NS4A蛋白为跨膜蛋白，NS4A的N端是NS3的辅助因子，可调节NS3的核苷酸三磷酸酶活性参与JEV复制[27]。Yuan等[28]构建了针对NS4A基因的shRNA质粒，可降低细胞中JEV mRNA 82.0%，降低病毒滴度640倍，使用shRNA质粒注射小鼠后JEV感染小鼠，发现小鼠脑中的病毒载量降低800倍小鼠存活率为50%，表明NS4A是RNAi治疗的潜在靶标。

2.7 NS4B蛋白

NS4B蛋白为疏水蛋白具有膜修饰功能，NS4B蛋白具有5段疏水区域，其中3段为跨膜区域可协助于蛋白定位于内质网上。NS4B膜外区域可与NS3解旋酶直接相互作用，过表达NS4B膜外区域可抑制JEV复制，降低病毒滴度约50%[25]，表明NS4B膜外区域可影响JEV复制。JEV感染细胞可诱导内质网应激引起细胞凋亡。Wang等[29]发现NS4B蛋白可与PERK互作，NS4B中的LIG-FHA和LIG-WD40结构域可诱导PERK发生二聚化激活PERK，Neuro-2a细胞过表达NS4B可激活PERK诱导细胞凋亡，NS4B在JEV所诱导的细胞凋亡中起着正向调控的作用。

2.8 NS5蛋白

NS5蛋白是最大的黄病毒蛋白，具有病毒复制所需的甲基转移酶和RNA依赖性RNA聚合酶活性，NS5蛋白RdRP结构域可与Hsp70直接相互作用[30-31]。NS5蛋白参与细胞抗病毒反应的发生，Yang等[32]研究发现NS5蛋白可下调钙网蛋白，钙网蛋白下调可上调细胞内Ca2+水平，同时抑制STAT1、NFAT-1对IFN-β的核转运，拮抗细胞抗病毒反应。Ye等[33]研究发现NS5蛋白不影响IκBα和IRF3的磷酸化，但可通过竞争性的与入核蛋白KPNA3和KPNA4相互作用，抑制IRF3和NF-κB进入细胞核减少Ⅰ型干扰素的产生，过表达KPNA3和KPNA4可恢复IRF3和NF-κB活性，恢复Ⅰ型干扰素产生，该研究揭示了JEV 利用NS5蛋白逃避宿主天然免疫反应的新机制。Weng等[34]研究发现NS5蛋白可与Hsp70互作上调Hsp70表达，Hsp70上调可减少IFN-β诱导的ERK2、p38、MAPK和STAT1的磷酸化，抑制细胞凋亡，表明NS5蛋白具有拮抗细胞凋亡的作用。

3 小结

JEV 7个非结构蛋白在其发挥生物学功能过程中扮演着不同的角色，目前研究表明，超过一半的非结构蛋白都与JEV复制有关。其中NS3、NS4B、NS5还可通过调控JEV多诱导的炎症反应和细胞凋亡参与JEV致病过程；NS1′、NS2A、NS3、NS4B、NS5蛋白可拮抗细胞天然抗病毒反应；NS1蛋白可成为JEV感染的诊断标志，以及亚单位疫苗开发的优势蛋白，NS1′蛋白因为其产生的特殊性更可成为区分疫苗毒和野毒株的关键蛋白。JEV非结构蛋白的功能见表1。

表1 JEV非结构蛋白功能

由此可见，JEV非结构蛋白参与病毒的复制、致病，以及引起的天然免疫反应，并且同一非结构蛋白可具有以上多个功能，并且蛋白功能之间也存在着相互影响，JEV非结构蛋白功能是复杂且重要的。因此，了解JEV非结构蛋白功能，不仅有助于我们了解JEV的生物学特性，深入剖析其致病机制，更有助于我们了解变异JEV生物学功能，更能为JEV疫苗及药物的研发提供参考。虽然，目前部分非结构蛋白的功能和作用机制还不完善，但随着分子生物学技术的不断进步JEV非结构蛋白更多潜在的功能将会被发现。