口服纳米氧化锌对堆型艾美耳球虫感染的防治效果

徐立新，陈秋阳，史嘉雯，孙晓婷，宋小凯，严若峰，李祥瑞

(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)是引起鸡球虫病常见球虫种之一，其主要寄生于十二指肠的肠道上皮细胞内。球虫虫体在肠上皮细胞内进行裂殖生殖和配子生殖，使肠道组织受到损伤和破坏，导致对营养物质及锌等的吸收障碍，增重减少，机体细胞的抗氧化能力和免疫功能下降，严重的可导致鸡死亡[1-3]。目前商业养殖中防治鸡球虫病的主要方法仍然是使用药物或球虫疫苗进行免疫防治，但均不能取得理想效果。

锌是机体的重要微量元素之一，是多种酶和蛋白的组成成分[4-5]，在促进机体生长、伤口愈合和增强机体免疫力等方面具有重要作用[6-7]。在动物饲养过程中，常以氧化锌的形式经饲料添加。氧化锌能够维护肠道的完整、促进肠道健康生长，提高营养物质的消化利用[8]；但氧化锌大部分会被胃酸分解成Zn2+，仅有少部分能进入肠道，导致氧化锌的生物利用率低[9-10]。纳米氧化锌(ZnO nanoparticles，ZnO NPs)可以以完整的氧化锌颗粒经胃后进入肠道，从而发挥其抗菌活化缓解细胞损伤、修复肠道黏膜、增强抗氧化损伤和机体免疫的能力[11-12]。

本研究拟通过口服纳米氧化锌抗堆型艾美耳球虫感染的试验，探讨纳米氧化锌作为添加剂在抗球虫病中使用的可行性，为提高抗球虫药物、活球虫疫苗或基因工程疫苗防治鸡球虫病的效果提供新的辅助方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄白羽雏公鸡，购自海安县双利孵禽场，饲养于无球虫的环境中，饲喂不含抗球虫药物的全价颗粒日粮，自由采食和饮水。

1.2 堆型艾美耳球虫卵囊

本实验室保存的孢子化卵囊，用前经传代扩增。孢子化卵囊置于10倍体积的重铬酸钾溶液中，4 ℃保存备用。

1.3 主要试剂

胃蛋白酶(S10028-100 g，源叶生物)；纳米氧化锌分散液(上海麦克林生化科技有限公司)。

1.4 试验动物分组

将饲养至14日龄的鸡逐个称重，选择体重相近鸡360羽，随机分成12组(A至L组)，每组30羽，每组分3个重复，每个重复10羽。分别为空白对照组；纳米氧化锌剂量筛选试验：10×104个孢子化卵囊感染鸡，分别口服去离子水对照和5、10、20、30 mg纳米氧化锌5组；纳米氧化锌抗不同剂量球虫感染试验：口服20 mg纳米氧化锌，分别用5×104、2.5×104、1×104孢子化卵囊进行感染及对应口服去离子水对照6组。试验动物分组、卵囊感染量和口服纳米氧化锌剂量见表1。

表1 试验动物分组及处理

1.5 球虫孢子化卵囊感染方法和纳米氧化锌的口服方法

取试验所需剂量的孢子化卵囊，离心，加去离子水重悬，重复数次确保洗净重铬酸钾后，加去离子水稀释并进行卵囊计数。按表1所示卵囊数量，用1 mL注射器吸取相应剂量卵囊混匀液，经口腔注入鸡嗉囊。

同时，按表1所示将相应剂量的纳米氧化锌分散于600 μL去离子水中，用1 mL注射器吸取相应剂量纳米氧化锌经口腔注入鸡嗉囊，每日1次，直至感染后第7天剖杀。

所有试验鸡，按每个重复饲养于一个自制的饲养盒中，自由采食和饮水。

1.6 增重和存活率

在感染E.acervulina孢子化卵囊前和宰杀前分别逐个鸡称重，计算平均增重和相对增重率。试验期间每天观察鸡只生活情况，对死亡鸡，及时剖检，判断是否为球虫感染引起的死亡，并记录死亡数，计算存活率。

平均增重=宰杀前平均体重-感染卵囊前平均体重；

相对增重率(%)=试验组平均增重/不感染不口服纳米氧化锌组平均增重×100%；

存活率(%)=组内存活鸡数/组内总的鸡数×100%。

1.7 排出卵囊数和卵囊值

收集感染后第4～7天排出的粪便，用麦克马斯特法计算粪便卵囊数。宰杀后取十二指肠用消化液消化计算十二指肠中卵囊数。

排出卵囊数=试验期排出粪便中卵囊数总和+十二指肠中卵囊数；

卵囊减少率(%)=(试验组内排出卵囊数-组内感染不口服纳米氧化锌组排出卵囊数)/组内感染不口服纳米氧化锌组排出卵囊数×100%；

卵囊比数(%)=试验组内排出卵囊数/组内感染不口服纳米氧化锌组排出卵囊数×100%；

如果卵囊比数为0%～1%时，则卵囊值为0；相应卵囊比数为1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%，卵囊值分别记为5、10、20、40。

1.8 十二指肠病变记分

感染卵囊后第7天，宰杀全部试验鸡，逐个剖检并观察十二指肠病变，并按Johnson等[13]设计的病变记分标准进行病变记分。

病变值=病变记分×10。

1.9 抗球虫指数

抗球虫指数(anticoccidial indes，ACI)按下列公式进行计算：

ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。

1.10 数据统计分析

各组试验数据以“平均值±标准差”表示，经SPSS软件运行方差分析(One-way ANOVA)对各组数据进行统计分析。

2 结果

2.1 增重和存活率

从鸡只的增重方面来看，纳米氧化锌剂量筛选试验结果显示，口服5、10、20和30 mg的纳米氧化锌都能使10×104个孢子化卵囊感染的鸡的增重显著高于感染未口服纳米氧化锌组(P<0.05)，其中口服20 mg纳米氧化锌中的增重效果最好，相对增重率达到70.36%，与预试验结果一致。口服20 mg纳米氧化锌抗不同感染剂量结果显示，随着感染剂量从1×104、2.5×104、5×104到10×104个卵囊的增加引起鸡增重损失增加，而在口服20 mg纳米氧化锌后，其增重损失都能得到一定的减少，对超过5×104个卵囊的感染剂量减少增重的效果显著(P<0.05)，甚至对低剂量的1×104个孢子化卵囊感染鸡增重有一定促进增重的作用，其相对增重率为101.73%，超过了空白对照组(表2)。增重结果说明，口服纳米氧化锌能明显减少由于E.acervulina感染引起的增重损失，提高相对增重率。

从存活率方面来看，纳米氧化锌剂量筛选试验结果显示，口服5 mg的纳米氧化锌能将鸡的存活率从87.5%增加到96.43%，20 mg以上时存活率达100%。抗不同感染剂量试验结果显示，感染剂量达到2.5×104个卵囊以上就能引起试验鸡死亡(存活率96.67%)，说明E.acervulina对鸡有致死作用，而口服20 mg纳米氧化锌能够使鸡的存活率达到100%，即减少鸡只的死亡，增加了存活率。

表2 试验鸡增重、存活率、卵囊排出量、病变记分和ACI结果

2.2 排出卵囊数

纳米氧化锌剂量筛选试验结果显示，口服每种剂量的纳米氧化锌都能显著减少卵囊排出数(P<0.05)，其中口服10 mg的效果最好，卵囊排出减少率36.45%，卵囊比数是4种剂量中最低为63.55；从卵囊值比较来看，每种剂量比未口服的卵囊值降低1个等级，从40降为20，但每种剂量间的卵囊值无影响。

抗不同感染剂量试验结果显示，口服纳米氧化锌能显著降低1×104和10×104个孢子化卵囊感染鸡排出卵囊数(P<0.05)，其中感染1×104个组的卵囊排出减少率为50.9%，卵囊值降低了2个等级，从40降为10；而对2.5×104和5×104个感染组的卵囊排出数(P>0.05)、卵囊排出减少率和卵囊值没有明显影响。

从排出卵囊数的结果说明，口服纳米氧化锌能够降少感染鸡的卵囊排出量，减少卵囊排出率，降低卵囊值。从感染而未口服纳米氧化锌各组排出卵囊数量来看，平均每个感染卵囊的产量会随着感染卵囊的剂量降低逐渐增加。

2.3 十二指肠病变记分

纳米氧化锌剂量筛选试验结果显示，口服每种剂量的纳米氧化锌比未口服纳米氧化锌组十二指肠病变记分显著降低(P<0.05)，其中口服30 mg的效果最好，病变记分降低最多，从平均2.71降为1.12分，而与口服20 mg纳米氧化锌间十二指肠病变记分差异不显著(P>0.05)。

抗不同感染剂量试验结果显示，口服纳米氧化锌能使10×104、5×104和2.5×104个孢子化卵囊感染鸡的十二指肠病变记分显著减少(P<0.05)，其中对10×104感染鸡组减轻的病变记分值最多，从2.71降为1.26分。

十二指肠病变记分结果说明，口服纳米氧化锌能减轻E.acervulina孢子化卵囊感染引起的鸡十二指肠肠道损伤。

2.4 抗球虫指数

根据试验鸡的相对增重率、存活率、卵囊值和病变值计算得到ACI，见表2。纳米氧化锌剂量筛选试验结果显示，随着口服纳米氧化锌的剂量增加，对E.acervulina感染的防治效果越好，在20、30 mg/羽时效果较强，ACI值达到137.75和138.04，且每种剂量的ACI值都超过了120，说明口服纳米氧化锌虽然对控制球虫的效果不满意但仍可以用于抗球虫感染。抗不同感染剂量试验结果显示，随着感染孢子化卵囊数量的减少，抗球虫感染的效果有愈加明显的趋势；在感染剂量为1×104个卵囊时，ACI可达到180以上，起到了很好的防治球虫效果，说明可用作抗球虫药。

3 讨论

艾美耳球虫孢子化卵囊进入鸡体后，释放出的子孢子主要侵入十二指肠上皮细胞，子孢子、裂殖子、配子体等在肠道上皮细胞中反复大量增殖，从而导致绒毛上皮细胞变性、坏死，黏膜层萎缩、脱落[14]；使肠黏膜的完整性受到破坏，肠道黏膜受到损伤，黏膜细胞间连接增宽，通透性增加，进而血浆蛋白漏入肠腔[15]；肠道平滑肌收缩蠕动变慢[16]；肠道黏膜损伤，也使得上皮细胞对营养物质的吸收减少；同时会引起肠道对蛋白[17]、脂肪消化吸收不良[18]，使钙离子形成不溶性钙皂，又使肠道对葡萄糖、钙、钾、钠离子吸收能力下降，加之细胞崩解，使血钾浓度升高，造成机体电解质代谢紊乱等，导致鸡的精神不佳，生长停滞，体重增长受到影响，严重感染时甚至引起死亡[19-21]。有研究发现E.acervulina感染能明显影响鸡的增重，而且随着E.acervulina感染剂量的增加，增重减少更明显[22-23]。本试验研究也证明随着E.acervulina孢子化卵囊感染剂量从1×104到10×104的增加，相对增重率从99.63%降到47.02%。

鸡在感染球虫的过程中，球虫还会破坏机体抗氧化体系的平衡，使一些金属酶类如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和VA、VC、VE、硒含量显著降低，而丙二醛、过氧化氢含量升高，加剧了细胞的损伤[24-25]。若在饲粮中添加抗氧化剂物质则可以提高鸡体的抗氧化能力，降低丙二醛含量[26]，进而改善肠道健康和抗氧化状态，促进球虫感染鸡的生长性能[27]。试验结果也显示，E.acervulina感染会使肠道病变随感染剂量增加而加剧，增重效率降低。

为了改善感染鸡的生长性能，在饲料中添加氧化锌来补充因E.acervulina感染使肝脏中的金属硫蛋白增加致鸡体血清和血浆中Zn浓度的降低[28]，而导致的锌缺乏是可行方法之一。通过饲料中添加锌或含Zn2+物质的方法可以减少肠炎引起的死亡率[10]，缩短药物治愈球虫病的时间[29]，改善球虫感染造成的生长发育迟缓[30]。有研究显示，高剂量的氧化锌可以控制肠道病原微生物的生长[31]，改善肠道吸收率，增强抗氧化状态[12]。然而，高剂量的氧化锌会导致消化道微生态紊乱，且粪便中排出的锌含量增加，造成环境污染危及人类健康[31-32]。纳米氧化锌则具有更高的生物利用率[33]，低浓度的纳米氧化锌就对奶牛小肠上皮细胞的增殖[34]和小鼠的细胞能量代谢有促进作用，能促进细胞生长，增强细胞蛋白代谢相关酶活，提高细胞蛋白的沉积；并能保护小鼠肠上皮细胞的完整性，减少细胞膜的脂质过氧化，维持细胞的抗氧化酶活性，提高细胞抗氧化能力，减轻细胞的氧化损伤[35]。同时研究证实，纳米氧化锌具有通过细胞毒性作用等机制杀伤白血病细胞和多种肿瘤细胞的能力[36]。本试验结果也说明饲料中添加纳米氧化锌不仅能提高E.acervulina感染鸡的增重，减少肠道病变造成的损伤程度，而且能减少卵囊排出的数量。推测可能纳米氧化锌还对球虫各繁殖阶段虫体有一定的杀灭作用。

综上，本试验研究证实，口服适量纳米氧化锌能够改善E.acervulina感染鸡的增重，减少死亡率，减少鸡排出卵囊的数量，减轻十二指肠肠道的损伤。因而，饲喂合适剂量的纳米氧化锌可有效防治球虫病。