鹅星状病毒感染在河南地区的分子流行病学调查

金前跃，郭永刚，李俊朋，秦保亮，王寅彪，郭振华，杜永坤，万博，邢广旭，张改平,*

(1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院中英禽病国际研究中心，河南 郑州 450002；3.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；4.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046；5.平顶山市农业科学院畜牧研究中心，河南 平顶山 467001；6.新乡市动物疫病预防控制中心，河南 新乡 453003；7.新乡医学院公共卫生学院，河南 新乡 453003；8.河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450002)

鹅星状病毒(goose astrovirus，GAstV)属于星状病毒科(Astrovirus)、禽星状病毒属(Avastrovirus)，是一种无囊膜、单股正链RNA病毒，呈二十面体结构；基因组大小约6.1～7.9 kb，由1个5′非翻译区、3个开放阅读框(ORF)、1个3′非翻译区和1个Poly A尾组成[1-3]。病毒主要编码3种蛋白:ORF1a、ORF1b分别编码蛋白酶和RNA聚合酶；ORF2编码衣壳蛋白(capsid)，是病毒主要结构蛋白[4-5]。

禽星状病毒主要感染鸭、火鸡、鸡等，引起肠道疾病、肝炎、肾炎等[6-8]。当前流行的鹅星状病毒以雏鹅痛风为特征病变，该病主要发生于2～25日龄雏鹅，常年可见，患病雏鹅精神沉郁、采食量减少、严重者死亡，死亡率最高可达50%，剖检可见内脏器官尿酸盐沉积、肾炎、脚关节充满白色浆液等病理变化[9-12]。

2017年以来，鹅星状病毒感染引起的雏鹅痛风在国内多个省份如山东、江苏、安徽、河南、黑龙江、广东等地区暴发[13-16]，严重制约了当地养鹅产业的发展。

本研究借助分子生物学手段，对河南地区鹅星状病毒疑似病料进行了RT-PCR检测、序列测定、同源性及系统进化分析，获得了河南地区鹅星状病毒流行病学相关信息，为鹅痛风病的有效防控提供了思路和线索。

1 材料与方法

1.1 病料

病料采自2018年河南省12个发病养鹅场患有痛风的病鹅肝脏组织，主要分布在郑州、焦作、新乡、鹤壁、开封、商丘、许昌、平顶山、周口、漯河、驻马店、信阳等地市(表1)。

1.2 主要试剂

青链霉素混合液购自Solarbio公司；DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、病毒基因组提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix)购自TaKaRa公司；Q5超保真DNA聚合酶、dNTPs购自New England Biolabs；pEASY-Blunt Cloning Kit购自Transgen Biotech；通用型DNA纯化回收试剂盒(Universial DNA Purificiation Kit)购自Tiangen。

表1 临床样品信息

1.3 病料的处理

无菌条件下取适量病料，以1∶3的质量体积比加入含青链霉素的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)彻底研磨。将组织研磨液收集于无菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室温间反复冻融3次，10 000 r/mim离心15 min，使用0.22 μm的滤器过滤上清液并冻存于-80 ℃冰箱。

1.4 RT-PCR检测及测序

根据AstV/SDPY/Goose/1116/17毒株(GenBank登录号：MH052598.1)的RNA聚合酶基因ORF1b序列分别设计检测和测序引物。

检测引物：上游序列为5′-ACCCCTGGTTATCCAAAATTTAAGT-3′，下游序列为5′-CCGCCAGAAGAGAGGCTTGGGCAAC-3′，预期片段大小为420 bp。测序引物：上游序列为5′-AAAAAACTAGATAAGGGGGACGATG-3′，下游序列为5′-TCACCAGATTTGAGAAAAGAAGTCG-3′，预期片段大小1 551 bp。

按照病毒核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix进行反转录，获取病毒cDNA作为PCR模板。PCR反应为20 μL体系：模板、上下游引物各1 μL，DNA聚合酶10 μL，双蒸水7 μL。

PCR检测反应条件为：顶盖温度99 ℃，预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃、1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反应。GAstV ORF1b阳性质粒与PBS分别作为阳性对照及阴性对照。采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

测序片段扩增条件为：顶盖温度99 ℃，预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火52 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 40 s，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反应。GAstV ORF1b阳性质粒与PBS分别作为阳性对照及阴性对照。采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。扩增产物使用DNA纯化回收试剂盒回收后，连接pEASY-Blunt载体送上海生工测序。

1.5 同源性及系统进化分析

利用DNAStar MegAlign软件中的Clustal W method模块，分析测序片段与GenBank中GAstV ORF1b片段的同源性；利用MEGA 6.06软件中的Clustal W程序完成序列比对，并采用邻接法(Neighbor-Joining tree)构建遗传进化树，步长值(Bootstrap value)设置为1 000。

2 结果

2.1 临床剖检

患病雏鹅解剖后可见明显的全身性内脏痛风症状，肾脏肿大、发白，输尿管、胆囊内均有尿酸盐沉积，心脏、肝脏、腺胃、肠道也不同程度附着有白色尿酸盐。

2.2 RT-PCR检测

对来自河南省12个地市养鹅场的36份发病鹅肝脏样品进行处理，分别提取核酸并反转录获得cDNA，最后进行PCR检测，结果均能扩增得到大小420 bp的条带(图1)，符合预期大小。统计结果显示(表2)，36份样品均为阳性，阳性率达100%。

M. DNA Marker；1～36.36份临床样品；P. 阳性对照；N. 阴性对照

表2 临床样品检测结果

2.3 ORF1b基因扩增及测序

本研究从12个不同地市的阳性养鹅场各取1份样品，提取核酸并反转录获得cDNA，通过RT-PCR扩增获得目的片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果显示，片段条带约1 551 bp(图2)，符合预期大小。扩增产物连接pEASY-Blunt载体并测序，获得的ORF1b 全长序列上传至GenBank数据库(表3)。

M. DNA Marker；1～12.12份临床样品；13.阳性对照；14. 阴性对照

2.4 同源性分析

将12个毒株ORF1b测序片段与GenBank中分离毒株的ORF1b片段进行同源性分析，结果显示12个毒株间的核苷酸同源性为98.7%～99.9%，与河南地区的XX(MN337323)、AstV/HN01/Goose/0103/18(MN307114)、AstV/HB01/Goose/0123/19(MN307118)、AstV/AH01/Goose/0512/18(MN307115)等代表毒株核苷酸同源性为97.9%～99.5%，与国内其他地区的GD(MG934571)、AstV/SDPY/Goose/1116/17(MN052598)、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01(MF772821)等代表毒株核苷酸同源性为98.4%～99.7%(图3)。

表3 测序毒株ORF1b信息

图3 基于GAstV ORF1b基因的核苷酸同源性分析

2.5 系统进化分析

选取12个测序毒株ORF1b基因序列及61个参考序列(表4)，利用MEGA 6.06软件构建了遗传进化树(图4)。系统进化分析显示，测序分析的12份临床样品毒株，与河南省其他分离毒株及国内当前流行毒株，处于同一进化分支，属于禽星状病毒1群。

表4 构建进化树所用毒株信息

●本研究测序毒株

3 讨论

鹅星状病毒感染引起的雏鹅痛风是一种新发传染病，主要表现为雏鹅肾肿、全身脏器尿酸盐沉积等症状，发病率和死亡率高，已成为养鹅产业的“头号杀手”[9-16]。本研究对河南地区12个地市的疑似样品进行检测，结果显示阳性率为100%，表明河南地区鹅星状病毒感染较为广泛，主要养殖区域需进一步加强防控力度。

本研究中的12个测序毒株与河南地区代表毒株核苷酸同源性在97%以上，与国内其他地区代表毒株核苷酸同源性在98%以上，表明当前河南地区流行的毒株较为一致，并且与国内其他地区毒株相似。系统进化分析显示，12份临床样品毒株，与河南省其他分离毒株及国内当前流行毒株，处于同一进化分支，属于禽星状病毒1群。由此可见，当前流行的鹅星状病毒传播迅速，具有共同的遗传学特征。

本研究的分子流行病学调查，明确了河南地区鹅星状病毒流行情况，并对毒株进行了测序、同源性及系统进化分析，从分子水平分析了河南流行毒株的遗传学特征，为有效开展鹅痛风病的防控提供了参考。