蓬子菜总黄酮经调控TGF-β/Smad3信号通路对内皮细胞增殖、凋亡的影响研究

徐 丹，陶永梅，宋 丹，赵冰冰，王 爽，周振兴，周 悦

(黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150000)

血管内皮细胞的主要生理功能是调节血管平滑肌张力、抗炎和抗血栓形成，血管内皮细胞功能障碍是导致心血管病变的重要因素[1-2]。转化生长因子-β(TGF-β)具有多重生物学作用，可维持血管壁正常结构，可抗炎、抗癌、保护动脉等；Smad3是TGF-β/Smad3信号通路中TGF-β下游的转导因子，其表达水平较高会导致血管平滑肌细胞、内膜增生，参与动脉粥样硬化发病过程[3-4]。蓬子菜总黄酮可通过抑制炎症反应保护血管内皮细胞[5]。本实验基于TGF-β/Smad3信号通路探讨了蓬子菜总黄酮对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、凋亡的影响，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1药物及细胞 蓬子菜总黄酮，纯度为75%，由黑龙江中医药大学提供，批号：20130115。HUVECs由南京凯基生物技术有限公司提供。

1.2主要试剂及仪器 1640培养基(美国Hyclon公司)；MTT试剂(Sigma公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(卡尔文生物科技有限公司)；TGF-β1、Smad3一抗(美国R&D公司)。CO2恒温培养箱(Heal Force公司)；倒置显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.3HUVECs培养及模型建立 将HUVECs放置在含10%新生牛血清的1640培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，使用PBS洗涤2遍，加入2 mL消化液(由0.02%的EDTA以及0.25%的胰酶配置)，在37 ℃条件下消化1 min。倒置显微镜观察发现细胞收缩变圆、细胞间隙增加后，去除消化液，再次加入2 mL的培养基消化终止。观察细胞贴壁情况，配置细胞悬液，及时更换培养基，继续培养48 h。实验分为5组，对照组HUVECs正常培养；模型组及低、中、高浓度蓬子菜总黄酮组均参考文献[6]方法建立H2O2氧化损伤模型(确定H2O2氧化损伤最佳的浓度为100 μmol/L，培养时间为4 h)，然后模型组常规培养，低、中、高浓度蓬子菜总黄酮组分别加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的蓬子菜总黄酮培养。

1.4检测指标及方法

1.4.1细胞增殖检测 采用MTT法检测细胞增殖情况：各组细胞培养24 h，摒弃96孔培养皿中的上清液，每孔中加入20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃环境中孵育4 h，弃掉上清液，每孔中再次加入200 μL的DMSO溶液，在37 ℃环境中摇床震荡10 min，通过全自动酶标仪在490 nm位置观察吸光度(A)。样本计数选择300个细胞，细胞增殖率=增殖细胞数/细胞总数×100%。

1.4.2细胞凋亡染色观察 各组HUVECs在25 cm2培养瓶中进行接种培养，长至70%，刺激48 h后加入TE对细胞进行消化和收集，加入PBS洗涤后，使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光黄以及碘化丙啶对细胞进行标记，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测HUVECs凋亡情况。AO/EB染色，在荧光显微镜下观察，样本计数选择300个细胞。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4.3氧化应激、血管功能相关指标检测 同实验1.3处理细胞后，取各组细胞上清液，加入96孔板，用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1～10 μg/mL)，每凹孔加0.3 mL，4 ℃过夜，或37 ℃水浴3 h，贮存于冰箱中。移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次，每次5 min。每凹孔加入0.2 mL用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37 ℃作用1～2 h。移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 mL用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37 ℃作用1～2 h或由预试实验确定作用时间。移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗3次，每次5 min。加入0.2 mL底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30 min(另设一空白对照，0.4 mL底物加0.1 mL终止剂),每凹孔加2 mol/L H2SO4或2 mol/L 柠檬酸0.05 mL终止反应。用酶标比色计测定492 nm处OD值。

1.4.4TGF-β/Smad3信号通路相关蛋白检测 采用Western blot检测:同1.3方法处理细胞后，取各组细胞上清液，10 000×g离心处理10 min，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100 ℃环境中加热5 min(有助于蛋白发生变性)。凝胶电泳完转膜，取膜，4 ℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理1 h，使用0.05%～0.1% TBST稀释一抗(TGF-β1、Smad3一抗为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次5 min，使用0.05%～0.1% TBST稀释二抗(1∶10 000)，摇动孵育1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，每次5 min。DAB显色，定量分析蛋白表达情况，以GAPDH为内参。

2 结 果

2.1各组HUVECs增殖、凋亡情况 模型组及各浓度蓬子菜总黄酮组细胞增殖率均明显低于对照组(P均<0.05)，凋亡率均明显高于对照组(P均<0.05)；模型组细胞增殖率、凋亡率与低浓度蓬子菜总黄酮组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；中浓度和高浓度蓬子菜总黄酮组细胞增殖率均明显高于模型组和低浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)，凋亡率明显低于模型组和低浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)；高浓度蓬子菜总黄酮组增殖率高于中浓度蓬子菜总黄酮组(P<0.05)，凋亡率明显低于中浓度蓬子菜总黄酮组(P<0.05)。见表1。

2.2各组HUVECs凋亡染色情况 对照组内皮细胞形态正常，表现为绿色弥散状；模型组凋亡的细胞表现为红色、橘红色，细胞核染色质发生固缩、碎裂，伴随凋亡小体出现；各浓度蓬子菜总黄酮组凋亡细胞数量均有不同程度减少，其中高浓度蓬子菜总黄酮组最明显。见图1。

2.3各组HUVECs中氧化应激、血管功能指标水平 模型组及各浓度蓬子菜总黄酮组SOD、CGRP水平均明显低于对照组(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明显高于对照组(P均<0.05)；各浓度蓬子菜总黄酮组SOD、CGRP水平均明显高于模型组(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明显低于模型组(P均<0.05)；中、高浓度蓬子菜总黄酮组SOD、CGRP水平均明显高于低浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明显低于低浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)；高浓度蓬子菜总黄酮组SOD、CGRP水平均明显高于中浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)，MDA、ET-1水平均明显低于中浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组人脐静脉内皮细胞中SOD、MDA、ET-1、CGRP水平比较

2.4各组HUVECs中TGF-β/Smad3信号通路相关蛋白表达情况 模型组及各浓度蓬子菜总黄酮组TGF-β1蛋白表达量均明显低于对照组(P均<0.05)，Smad3蛋白表达量均明显高于对照组(P均<0.05)；各浓度蓬子菜总黄酮组TGF-β1蛋白表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，Smad3蛋白表达量均明显低于模型组(P均<0.05)；中、高浓度蓬子菜总黄酮组TGF-β1蛋白表达量均明显高于低浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)，Smad3蛋白表达量均明显低于低浓度蓬子菜总黄酮组(P均<0.05)；高浓度蓬子菜总黄酮组TGF-β1蛋白量明显表达高于中浓度蓬子菜总黄酮组(P<0.05)，Smad3蛋白表达量明显低于中浓度蓬子菜总黄酮组(P<0.05)。见表3及图2。

图2 Western blot检测各组人脐静脉内皮细胞中TGF-β1、Smad3蛋白表达情况

表3 各组人脐静脉内皮细胞中TGF-β1、Smad3蛋白表达量比较

3 讨 论

内皮细胞增殖、凋亡处于一种动态平衡状态，当内皮细胞过度凋亡时会导致内皮功能失调，内皮细胞损伤，引发血管疾病[7-8]。本实验结果显示，模型组细胞增殖率较低，细胞凋亡率较高，说明内皮细胞损伤后细胞增殖被抑制，促进细胞凋亡；中、高浓度蓬子菜总黄酮组细胞增殖率均有不同程度的提高，细胞凋亡率有不同程度的降低，且高浓度蓬子菜总黄酮组效果更明显。说明蓬子菜总黄酮能抑制内皮细胞损伤凋亡，促进其增殖，有剂量依赖关系，与薛凤等[9]研究结果一致。

氧化应激反应会影响血管内皮细胞增殖，促进多种血管活性物质释放，是导致血管内皮细胞损伤的重要原因[10]。SOD可促进细胞内活性氧物质清除，从而维持细胞氧化与抗氧化平衡；MDA参与细胞脂质过氧化过程，可反映细胞氧化损伤严重程度[11-12]。蓬子菜总黄酮是蓬子菜中主要的生物活性成分，其可通过清除自由基，增强抗氧化酶活性起到抗氧化作用[6]。本实验结果显示，各浓度蓬子菜总黄酮组SOD水平均明显高于模型组，MDA水平均明显低于模型组，且高浓度蓬子菜总黄酮组改善更明显。证实蓬子菜总黄酮能明显减轻氧化应激反应，且呈浓度依赖，与张紫阳等[13]研究结果一致。

ET属于一种缩血管活性物质，ET-1主要由内皮细胞产生，其表达水平过高，会导致血管痉挛，引起组织缺氧缺血，是内源性损伤因子；CGRP是一种舒血管生物活性多肽，对心血管系统、神经系统有重要调节作用，是内源性保护因子[14-15]。本实验结果显示，各浓度蓬子菜总黄酮组CGRP水平均明显高于模型组，ET-1水平均明显低于模型组，且高浓度蓬子菜总黄酮组改善更明显。说明蓬子菜总黄酮能呈浓度依赖性改善血管功能。

TGF-β1/Smads信号转导途径与动脉粥样硬化有密切关系，TGF-β1通过Smad3介导参与动脉粥样硬化病理过程,Smad3与TGF-β介导的细胞增殖与凋亡、免疫监督与心血管发育等有紧密的联系[16-17]。张小卿等[18]以5J/cm2UVA辐射HDMEC建立紫外线光损伤的人真皮微血管内皮细胞模型,模型对照组细胞凋亡数显著上升,细胞培养上清液中TGF-β、Smad2/3表达降低，桃红四物汤含药血清能有效保护UVA诱导的真皮微血管内皮细胞损伤,其机制可能与激活TGF-β/Smad信号通路有关。本实验结果显示，各浓度蓬子菜总黄酮组TGF-β1蛋白表达量均明显高于模型组，Smad3蛋白表达量均明显低于模型组，且高浓度蓬子菜总黄酮组改善更明显。说明蓬子菜总黄酮能激活调控TGF-β/Smad3信号通路，保护内皮细胞。

综上所述，蓬子菜总黄酮能促进HUVECs增殖，抑制其凋亡，可通过调控TGF-β/Smad3信号通路，减轻细胞氧化应激反应，改善血管功能，从而对HUVECs起到保护作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。