CD24和Lgr5在结直肠息肉与结直肠癌中的表达分析

李宗寿，庞家武，江文明，何耀海

（防城港市第一人民医院消化内科，广西防城港 538021）

结直肠癌属于临床消化道常见的一种恶性肿瘤，主要指腹部结肠及直肠部位组织发生癌变，其以大便带黏液及血、大便次数增多为主要临床表现。随着肿瘤体积增大肠道逐渐变得狭窄，进而可引发肠梗阻症状（如腹痛、腹胀、排气困难等），威胁患者生命安全。结直肠息肉与结直肠癌疾病发生、发展存在密切联系[1]。相关报道指出，临床结直肠息肉患者行切除术后其结直肠发生癌变的概率显著降低[2]。目前临床上对结直肠息肉和结直肠癌的诊断多依靠与肿瘤干细胞相关的表面标志物，其中CD24和G蛋白偶联受体（Lgr5）Lgr5具有显著的指导作用，CD24是一种黏附分子，在许多肿瘤标本中均有高表达情况，其与肿瘤细胞的浸润、增殖存在显著联系；Lgr5在水平波动时可提示细胞过度增殖、分化，对肿瘤的形成发挥重要作用[3]。故本研究针对防城港市第一人民医院行肠镜活检的患者标本中CD24和Lgr5的表达情况进行分析，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年4月防城港市第一人民医院收治的120例结直肠息肉与结直肠癌患者作为研究对象，其中炎性增生型息肉30例，管状腺瘤型息肉30例，绒毛性腺瘤性息肉30例，结直肠癌30例，另选取20例肠镜检查显示正常黏膜者作为对照。息肉患者中直径＜1.0 cm的43例，1.0～2.0 cm的33例，＞2.0 cm的14例；息肉无异型增生31例；低级别上皮内瘤变30例，高级别上皮内瘤变29例，癌变30例。诊断标准：参照《临床诊疗指南：外科学分册》[4]中关于结直肠息肉与结直肠癌的相关诊断标准。纳入标准：符合上述诊断标准者，且患者均行病理组织活检分别确诊为结直肠息肉（炎性增生型、绒毛性腺瘤型、管状腺瘤型息肉）及结直肠癌；结直肠息肉患者存在便血、腹痛等表现，结肠镜检查观察到凸起样病灶。结直肠癌患者腹部可触及质硬、表面欠光滑、活动度不大的包块，大便潜血呈阳性，结肠镜可观察到肿瘤浸润深度及周围淋巴结转移情况，血清癌胚抗原水平异常。排除标准：标本质量不合格者；遗传性结直肠癌者。此项研究经院内医学伦理委员会审核批准，患者或家属签署知情同意书。

1.2 方法 ①标本固定使用10%中性甲醛溶液，普通石蜡进行包埋。②免疫组化染色：先进行预实验，即依据染色效果明确Lgr5第一抗体最佳浓度在1∶100，CD24第一抗体最佳浓度应当在1∶200，使用已知阳性片作为阳性对照，将磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为空白对照。具体实施步骤为①脱蜡、脱水处理：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min，随后分别置于无水乙醇、95%乙醇以及75%乙醇中各浸泡5 min，再放入PBS中浸泡10 min；②将内源性过氧化物酶活性去除：使用3% H2O2溶液浸泡切片10 min后再用PBS进行冲洗3次，5 min/次；③抗原修复：切片置于柠檬酸钠缓冲液（SSC）容器（pH值为6.0）内借助700 W微波加热10 min使抗原修复，冷却至室温后再用PBS冲洗3次，5 min/次；④加一抗：分别滴加Lgr5与CD24的抗体，置于冰箱内（4 ℃）进行24 h孵育后再放入温箱（37 ℃）15 min复温，采用PBS进行3次冲洗，5 min/次；⑤加二抗：方法与加一抗操作一致；⑥二氨基联苯胺（DAB）显色：显色比例为1∶50，医师于镜下观察染色程度，确认染色满意后进行封片；⑦苏木素复染细胞核：逆梯度酒精脱水、二甲苯透明，再使用中性树胶进行封片，最后借助显微镜进行结果观察并摄片。

1.3 观察指标 ①Lgr5及CD24阴性与阳性表达情况，借助显微镜对组织切片显色反应进行观察，高倍镜下（×200）每张切片随机选择5个视野观察并计数。染色强度评估：0分为没有染色；1分为轻度染色；2分为中度染色；3分为强度染色。染色细胞面积定量计分：0分为未见细胞染色；1分为细胞被染色占比＜25%；2分为细胞被染色占比25%～50%；3分为细胞被染色占比＞50%。两种计分相乘得出检测总结果，若总分在2分以上则提示结果为阳性，2分以下为阴性。②分析Lgr5在各种结直肠疾病中表达情况。③分析Lgr5在各种结直肠疾病中表达情况。④分析CD24在各种结直肠疾病中表达情况。⑤分析Lgr5及CD24表达与结直肠息肉异型增生的相关性。⑥分析结直肠息肉患者Lgr5阳性表达分布情况。⑦分析结直肠息肉患者CD24阳性表达分布情况。

1.4 统计学分析 应用SPSS 21.0统计软件分析处理文中数据，计数资料以[例(%)]表示，行χ2检验，多组间计数资料采用χ2趋势检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Lgr5及CD24阴性与阳性表达情况 提取正常黏膜、炎性息肉及结肠腺癌标本各1例，其中正常黏膜组织中未见Lgr5表达，见图1；炎性息肉组织Lgr5有轻微表达，见图2；Lgr5的表达主要定位于细胞质中，以胞质呈红色或紫色为阳性染色，在腺癌组织内表现为强阳性，见图3；正常黏膜组织及炎性息肉组织中未见CD24表达，见图4、图5；CD24的表达主要定位于细胞膜，阳性反应为细胞膜黄色或棕黄色，在腺癌组织内表现为强阳性，见图6。

图1 Lgr5在正常黏膜中的表达（×200）

图2 Lgr5在炎性息肉中的表达（×400）

图3 Lgr5在结直肠癌中的表达（×200）

图4 CD24在正常黏膜中的表达（×200）

图5 CD24在炎性息肉中的表达（×400）

图6 CD24在结直肠癌中的表达（×200）

2.2 Lgr5在各种结直肠疾病中表达情况 Lgr5在管状腺瘤型、绒毛性腺瘤型息肉组及结直肠癌中的表达阳性率均显著高于在正常黏膜及炎性增生型息肉中的表达阳性率，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 Lgr5在各种结直肠疾病中表达情况

2.3 CD24在各种结直肠疾病中表达情况 CD24在管状腺瘤型、绒毛性腺瘤型息肉及结直肠癌中的表达阳性率均显著高于在正常黏膜及炎性增生型息肉中的表达阳性率，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 CD24在各种结直肠疾病中的表达情况

2.4 Lgr5及CD24表达与结直肠息肉异型增生的相关性 CD24、Lgr5在低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、结直肠癌患者中的表达阳性率均显著高于无异型增生，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 Lgr5及CD24表达与结直肠息肉异型增生的相关性[例(%)]

2.5 结直肠息肉患者Lgr5阳性表达分布情况 高分化组及中分化患者Lgr5表达阳性率显著低于低分化；40岁 ～ 60岁及 ＞60岁患者的CD24表达阳性率显著高于 ＜40岁；Lgr5在＞2.0 cm及1.0～2.0 cm组表达阳性率显著高于＜1.0 cm，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

表4 结直肠息肉患者Lgr5阳性表达分布情况

2.6 结直肠息肉患者CD24阳性表达分布情况 高分化及中分化患者的CD24表达阳性率显著低于低分化；40岁 ～ 60岁及 ＞60岁患者的CD24表达阳性率显著高于 ＜40岁；CD24在息肉 ＞2.0 cm及1.0～2.0 cm患者中的表达阳性率显著高于＜1.0 cm，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

表5 结直肠息肉患者CD24阳性表达分布情况

3 讨论

肿瘤干细胞在机体癌变过程中发挥重要作用，能够促进恶性肿瘤组织的形成、转移，同时也属于癌症复发与肿瘤耐药等方面的根本原因[5-6]。肿瘤干细胞可以借助特异性表面标志实施分离纯化，其中常见标志物主要包括CD24、CD44、CD133、CD166、Lgr5以及EpCAM等，通过对这些肿瘤干细胞特异性表面标志物表达水平进行测定，一定程度上能够判定患者结直肠部位是否癌变，早期给予明确诊断并实施针对性治疗措施，以促进预后改善[7-8]。

CD24属于低分子量高度糖基化的黏蛋白样的黏附分子，其可借助糖基磷脂酰肌醇而在细胞膜糖脂富集区域进行锚定；有研究指出，CD24高表达与肿瘤恶性倾向存在密切联系，容易对患者疾病预后产生不良影响[9-10]。Lgr5作为糖蛋白激素类受体，可以跨越细胞膜，最早发现其在骨骼肌、胎盘、脑组织及脊髓中均有表达，可对胎盘组织分化与生长起到控制作用[11-12]。有研究指出，CD24及Lgr5在结直肠绒毛性腺瘤型息肉及腺癌组均呈高表达，二者可作为结直肠息肉恶变的重要参考指标以明确结直肠癌的诊断，与本文结果基本相符[13-14]。本研究中，Lgr5及CD24在管状腺瘤型、绒毛性腺瘤型息肉及结直肠癌中阳性率均显著高于正常黏膜组及炎性增生型组，充分说明CD24参与结直肠癌多级癌变演进的早期阶段，在肿瘤细胞生长调节、增殖、侵袭与淋巴结发生远处转移等过程中发挥重要作用；而Lgr5在肝癌、卵巢癌、结直肠癌及基底细胞癌中均具有高表达。有相关指南提出，大肠癌变主要筛查40岁以上群体，其认为＞40岁属于息肉癌变的高危因素[15-16]。本研究中，40岁 ～ 60岁及 ＞60岁群体的CD24阳性率显著高于 ＜40岁组，充分证实上述结论。高分化组及中分化组结肠癌患者Lgr5及CD24表达率显著高于低分化结肠癌患者，说明Lgr5及CD24阳性表达越高，患者恶性程度越高。

综上，Lgr5及CD24表达率在正常黏膜、炎性增生型息肉、管状腺瘤型息肉、绒毛性腺瘤型息肉及结直肠癌中阳性表达率呈递增式升高；Lgr5及CD24阳性率也随着息肉直径的增大而上升；结直肠癌患者Lgr5及CD24表达率随着分化程度升高而上升；CD24表达与患者年龄呈正相关，Lgr5与年龄无关，二者阳性表达均与性别不相关。Lgr5及CD24可作为结直肠性息肉恶变的依据。同时，两者高表达对结直肠癌的诊断具有较高的指导作用。