HPLC-ELSD 法测定不同品系金线莲中金线莲苷的含量

黄晓萱，张嘉嘉，杨 漪，林 羽，张 勋

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

金线莲为兰科植物花叶开唇兰［Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.］的干燥全草，为闽台特色药材［1］。 金线莲性平，味甘，归肺、肝、肾、膀胱经，具有清热凉血、祛风利湿的功效，主治肾炎、膀胱炎、糖尿病、支气管炎、小儿急惊风等病症［2］。 金线莲苷为金线莲主要活性成分，现代药理研究表明金线莲苷具有降血糖［3］、降血脂［4］、保肝护肝［5］和改善骨质疏松［6］等作用。 课题组前期调研发现：福建金线莲具有多种不同外观性状，形成不同品系，包括大圆叶、小圆叶、尖叶等［7］。 金线莲中金线莲苷含量的测定方法已有相关报道，但目前为止尚少有对不同品系金线莲的金线莲苷含量的分析评价。 本研究拟通过高效液相色谱联合蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）方法实现对不同品系金线莲的金线莲苷含量测定，以期为金线莲药材的质量标准制定提供一定的参考依据。

1 材 料

1.1 实验仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪、Alltech 3300 蒸发光散射检测器（美国GRACE 公司）；万分之一 AR224CN 电子天平、十万分之一EX225DZH 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MILLI-Q Direct16 超纯水机（美国 Millipore公司）。

1.2 实验材料 金线莲苷对照品（上海同田生物技术有限公司，批号：18081329）；甲醇、乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；色谱乙腈（上海默克化工技术有限公司）；实验用水采用自制二次蒸馏水。 种植金线莲18 批，经福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴定为 Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.的全草，样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取金线莲苷对照品适量，加入甲醇超声溶解，定容配制成金线莲苷对照品溶液（即每1 mL 含2.012 mg 的金线莲苷），于4 ℃冰箱保存，备用。

2.2 色谱柱的优化 分别考察了Uitimate®HPLC NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和 Waters XBridge®BEH Amide 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）对色谱峰的分离效果，结果Uitimate®HPLC NH2色谱柱基线平稳，色谱峰峰型尖锐且无裂峰出现，故选择此色谱柱来分析样品。

2.3 色谱条件与系统适应性 色谱柱：Uitimate®HPLC NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水（85∶15）；流速：1.0 mL／min；雾化室温度：70 ℃；进样量：10 μL；载气为高纯度氮气，氮气流速：1.5 L／min；增益值：8。

2.4 提取条件的优化 精密称取金线莲样品粉末约0.15 g，于50 mL 具塞三角烧瓶中，在超声功率350 W，频率50 kHz 条件下，考察不同提取溶剂的提取效果，分别考察了纯水、甲醇（20%、40%、60%、80%、100 %）、乙醇（20 %、40 %、60 %、75 %、95 %）的提取率，结果40 %甲醇的提取效率最高。 此外，对最佳提取时间（10、15、20、25、30 、40 min）和提取溶剂用量（20、30、40、50、60 mL）进行考察，选择提取溶剂用量50 mL， 超声提取15 min 作为提取条件。取18 批金线莲样品粉末，按上述最佳提取条件提取，放冷，0.45 μm 滤膜滤过，即得供试品溶液。精密吸取40 %甲醇、 对照品和供试品溶液各10 μL，按“2.3”项下色谱条件分别进样分析，理论塔数按金线莲苷峰计＞3 000。40 %甲醇、对照品和供试品溶液色谱图见图1。

图1 40 %甲醇、对照品及供试品溶液色谱图

2.5 线性关系 取“2.1”项下的金线莲苷对照品溶液，逐级稀释至 804.80、562.38、337.43、202.46、121.47、72.88、43.73 μg／mL，按“2.3”项下的色谱方法测定峰面积。以峰面积积分值（mAU）的对数值为纵坐标（Y），对照品的进样量（μg）的对数值为横坐标（X）进行线性回归，得金线莲苷线性回归方程：Y＝1.3370X＋7.384 9（r＝0.999 8），表明金线莲苷进样量在0.437～8.048 μg 范围内线性关系良好。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度实验 精密称取金线莲样品（批号20180518-2） 1 份，按“2.4”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进样分析，1 d 内连续进样6 次测定日内精密度，连续3 d 测定日间精密度。日内精密度RSD 为1.2 %，日间精密度RSD为2.7 %，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性实验 精密称取金线莲样品（批号20180518-2） 1 份，按“2.4”项下制备方法制备供试品溶液，置于室温 0、2、4、6、8、12、24 h 后，按“2.3”项下色谱条件测定金线莲苷的峰面积，计算金线莲苷含量。 含量RSD 小于3.0 %，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.6.3 重复性实验 精密称取金线莲样品（批号20180518-2） 6 份，按“2.4”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.3”项下测定金线莲苷的峰面积，计算金线莲苷含量。 含量RSD 为1.1 %，表明此方法具有良好的重复性。

2.6.4 回收率实验 精密称取已知含量的金线莲样品（批号 20180518-2，含量 25.24 %） 0.075 g，按低、中、高浓度（约相当于0.075 g 样品中所含金线莲苷量的50 %、100 %、150 %）添加金线莲苷对照品溶液。 每个浓度溶液按“2.4”项下制备方法平行制备3 份，按“2.3”项下色谱条件分别进样，计算加样回收率。 结果低、中、高浓度添加的加样回收率（n＝3）分别为 93.22 %、94.89 %、97.22 %，RSD 分别为1.8 %、1.6 %、2.0 %，平均加样回收率为95.11 %，RSD 为2.6 %，表明该方法回收率良好。

2.7 含量测定 将样品按照“2.4”项下制备方法制成供试品溶液，并按照“2.3”项下色谱条件进行色谱分析，得到结果运用“2.5”项中方程计算，测得金线莲苷含量。 见表2。

表2 样品金线莲含量测定结果

3 讨 论

本研究测定了尖叶、大圆叶、小圆叶3 个不同品系金线莲中金线莲苷含量，3 个品系均含有金线莲苷成分。 尖叶品系金线莲苷含量范围为22.47%～24.65%，均值为23.41%；大圆叶品系金莲苷含量范围为22.73%～27.02%，均值为25.17%；小圆叶品系中金线莲苷含量范围为19.39%～23.09%， 均值为21.14%。 同一品系各批次金线莲苷含量相差较大，可能与种苗来源、产地等因素有关。 不同品系种植金线莲间的金线莲苷含量相差不大。

本实验采用HPLC-ELSD 法，实现对不同品系金线莲中金线莲苷含量的测定，该方法简便、可靠、准确，可为金线莲的质量评价提供参考。