精制保和颗粒治疗溃疡性结肠炎的机制研究

程 瑛 ，陈晓萍 ，沈阿灵 ，李 捷 ，陈友琴 ，彭 军 *

（1. 福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2. 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3. 美国凯斯西储大学医学院，美国 克利夫兰 44106）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD），其特点是结肠黏膜的反复损伤和黏膜下层的慢性非特异性炎症反应。 UC 发病率高，且呈逐年上升的趋势，影响着全世界数百万人的健康［1-2］。 UC 发病机制复杂，现有研究表明：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎性因子对UC 的发生、发展具有重要的调控作用［3-8］。 精制保和颗粒（refined baohe granules，RBG）由中医经典处方保和丸精简化裁而来，全方由神曲、红藤、炒麦芽3 味药配伍组成。神曲健脾和胃、消食化积，红藤清热解毒、散结消肿，炒麦芽行气消食、健脾开胃，三者联用共奏健脾和胃、化瘀解毒的功效。 然而RBG 对UC 的治疗作用和机制尚未见报道，因此，本研究通过葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导构建 UC 小鼠模型， 探讨 RBG 对UC 小鼠的治疗作用及其可能的机制，以期为其临床应用的二次开发提供进一步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 DM4000B 倒置显微镜、病理切片机（德国Leika 公司）；石蜡包埋机、生物组织自动脱水机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；伊红染色液、苏木素染色液（北京索莱宝科技有限公司）；一抗 IL-6 抗体、TNF-α 抗体（美国 GeneTex公司）；免疫组化试剂盒、diaminobenzidine（DAB）显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；DSS（美国 MP Biochemical 公司）；RBG（江阴天江药业有限公司，批号：1707310）。

1.2 实验药物配制

1.2.1 RBG 溶液配制 0.3 g RBG 用双蒸水溶解配置成 150 mg／mL RBG 溶液，现配现用。

1.2.2 2% DSS 溶液配制 8 g DSS 粉末用双蒸水溶解配制成 2% DSS 溶液，避光处理，现配现用。

1.3 实验动物 5 周龄 SPF 级雄性 C57BL／6 小鼠24 只，体质量（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2014-0017。 实验期间，小鼠饲养于福建中医药大学实验动物中心 SPF级实验动物室，使用许可证号：SYXK（闽）2009-0001。

1.4 小鼠分组及给药 将24 只体质量、周龄相近的雄性C57BL／6 小鼠在福建中医药大学实验动物中心适应性喂养1 周后，按随机数字表法分成对照组、RBG 组、DSS 组和 DSS+RBG 组，每组 6 只。RBG组自由饮用双蒸水，同时给予0.2 mL RBG（药物浓度为 1.5 g／kg）灌胃，每日 1 次，连续灌胃 11 d；DSS组自由饮用2% DSS 连续7 d 后换回自由饮用双蒸水至11 d，同时给予等体积的双蒸水灌胃11 d，每日1 次；DSS+RBG 组自由饮用 2% DSS 连续 7 d 后换回自由饮用双蒸水至11 d，同时给予0.2 mL RBG灌胃，每日1 次，连续灌胃11 d；对照组自由饮用双蒸水同时灌胃等体积的双蒸水11 d，每日1 次。

1.5 疾病活动指数（DAI）评分检测 每日测量小鼠体质量，同时每2 d 检测小鼠大便性状、便血情况，参照文献［9］，计算疾病活动指数（DAI）评分。

DAI 评分＝体质量情况评分＋大便性状情况评分＋便血情况评分

1.6 取材 给药结束后，4 组小鼠经1.5%异氟烷气体麻醉取血；采用脱颈处死，冰上截取小鼠结肠，通过数码相机对结肠组织进行拍照，直尺测量结肠长度，电子天平称取结肠体质量；随后将结肠置于4%多聚甲醛中固定。

1.7 苏木素-伊红（HE）染色观察结肠病理形态

4%多聚甲醛中固定24 h 后的结肠组织经梯度乙醇进行脱水处理，之后二甲苯Ⅰ、Ⅱ进行透明，并依次放于石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行浸蜡处理后包埋；将结肠蜡块切成 5 μm 薄片，烤片 2 h 后，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ进行脱蜡和梯度乙醇水化处理；双蒸水冲洗后，进行苏木素-伊红溶液染色，晾干后树脂胶封片处理。 用 Leica DM 4000B 显微镜采集（400×）图像，观察结肠病理形态。

1.8 免疫组化（IHC）染色检测 IL-6 和 TNF-α 水平表达 石蜡切片按“1.7”项下水化处理后，抗原修复2～3 h，按照免疫组化试剂盒说明书，封闭1 h后，在4 ℃条件下过夜孵育一抗 IL-6 和 TNF-α（1∶200 稀释）；第2 日石蜡切片给予相应的二抗孵育30 min，接着用稀释液链霉亲和素-POD 工作液孵育1 h；PBS 清洗后进行DAB 染色和苏木素复染，水洗干后封片。 每组标本用Leica DM 4000B 显微镜随机采集5 个高倍镜视野（400×）图像，采用Image-pro plus 7.0 软件进行分析统计。 按Fromowitz综合计分法，计算不同代表图的阳性率平均值。阳性率平均值＜5%者为0 分；≥5%，＜25%为1 分；≥25%，＜50%者为2 分；≥50%，＜75%者为3 分；≥75%者为4 分。细胞染色强度的评定以染色深度判定：阴性为0 分，浅黄色但明显强于阴性对照者为1 分，黄色为 2 分，棕黄色为 3 分。 上述两项乘积为免疫组化评分［10］。

1.9 统计学方法 采用SPSS 23.0 软件进行数据统计分析。 计量资料服从正态分布者以（）表示，采用单因素方差分析中的LSD-t 法（方差齐）或Games-Howell 法（方差不齐）进行检验。

2 结 果

2.1 4 组小鼠体质量减轻率比较 结果见图 1。 与对照组比较，RBG 组小鼠体质量无显变化，而DSS组小鼠体质量明显减轻；与DSS 组比较，DSS+RBG组小鼠体质量无明显变化。

图1 4 组小鼠的体质量减轻率比较

2.2 4 组小鼠 DAI 评分比较 结果见图 2。与对照组比较，RBG 组 DAI 评分无变化，而 DSS 组 DAI 评分明显升高；与 DSS 组比较，DSS+RBG 组 DAI 评分显著降低。

图2 4 组小鼠的DAI 评分比较

2.3 4 组小鼠结肠长度和体质量比较 结果见图3～图5。 与对照组比较，RBG 组小鼠的粪便形状，以及结肠长度和体质量无变化，而DSS 组小鼠粪便不成型，且结肠长度明显缩短，体质量明显减轻；与DSS 组比较，DSS+RBG 组小鼠粪便不成型，结肠长度缩短和体质量减轻情况缓解。

图3 4 组小鼠结肠长度照片图

2.4 4 组小鼠结肠组织形态学比较 结果见图6。与对照组比较，RBG 组小鼠的结肠组织形态学无显著改变，而DSS 组小鼠的结肠黏膜紊乱，隐窝扭曲并有炎性细胞浸润；与DSS 组比较，DSS+RBG 组DSS鼠结肠组织黏膜紊乱改善。

图6 4 组小鼠结肠组织病理形态学光镜图（×200）

2.5 4 组小鼠结肠组织中IL-6 水平比较 结果见图7。 与对照组比较，RBG 组小鼠结肠组织IL-6 水平无显著变化，而DSS 组小鼠结肠组织中IL-6 水平明显上升；与DSS 组比较，DSS+RBG 组小鼠结肠组织IL-6 水平下降。

图7 4 组小鼠结肠组织中IL-6 免疫组化代表图及免疫组化评分比较

2.6 4 组小鼠结肠组织中TNF-α 水平比较 结果见图8。 与对照组比较，RBG 组小鼠结肠组织TNF-α 水平无变化，而DSS 组小鼠结肠组织中TNF-α水平明显上升；与DSS 组比较，DSS+RBG 组小鼠结肠组织TNF-α 水平下降。

3 讨 论

现有的研究已经表明DSS 诱导的小鼠UC 模型可表现出与人类 UC 相似的症状［11］。 DAI 评分、大便性状、结肠长度、体质量以及结肠的组织形态学改变等可直观反映疾病的进展情况，是临床上评价UC 炎症进程的重要指标［12］，因此本研究首先探讨了RBG对DSS 诱导的小鼠UC 临床症状的影响。 结果显示：RBG 可显著改善DSS 诱导的UC 小鼠的相关临床症状，包括DAI 评分增加、结肠缩短和结肠体质量减轻；与此同时，RBG 干预可改善结肠隐窝上皮变形、杯状细胞丢失、炎性细胞浸润和炎性反应，进而可缓解结肠黏膜和黏膜下层的组织病理学损伤。 由此可见，RBG 可通过缓解UC 的临床症状来发挥其治疗作用。

图8 4 组小鼠结肠组织中TNF-α 免疫组化代表图及免疫组化评分比较

UC 发病原因复杂多样，至今尚未明确阐明。 但现有的研究表明与多种促炎细胞因子相关［13－14］，其中TNF-α、IL-6 等炎性因子对UC 的发生发展具有重要的调控作用［6］。 在 UC 进程中，中性粒细胞、巨噬细胞和T 淋巴细胞等免疫细胞的活化增加，会导致促炎细胞因子（IL-6、TNF-α 等）的产生增加，从而进一步损害结肠黏膜，是UC 发生发展的重要因素［15-18］。 所以，我们进一步探讨了 RBG 对结肠组织中促炎症细胞因子表达的影响，研究结果显示：RBG干预可显著抑制DSS 诱导引起的促炎因子IL-6 和TNF-α 水平。 综上所述，RBG 通过抑制炎症因子IL-6 和TNF-α 在UC 结肠组织中的表达，这可能是其发挥治疗UC 的作用机制之一。