顶空毛细管气相色谱法测定阿维巴坦钠中三甲胺、三乙胺

2021-07-07孙玉双贾全表亚囡巩海雪鲍楠楠

化工与医药工程 2021年3期

孙玉双，贾全，表亚囡，巩海雪，鲍楠楠

（华北制药河北华民药业有限责任公司，石家庄 052165）

β-内酰胺类抗生素作为一种广谱抗菌药物，适应症广、临床疗效好，因此应用广泛，但是细菌对这类药物所产生的耐药性逐步增强，已严重降低其治疗效果，研制β-内酰胺酶抑制剂，作为增效剂与之联用，可有效地恢复耐药菌对抗菌药物的敏感性[1]；作为第一个用于临床的二氮杂双环辛烷类化合物，阿维巴坦可以长效抑酶[2]；同时，阿维巴坦也是一种新型的酶抑制剂，势必会得到广泛应用[3]；阿维巴坦原料药制备过程中，用到了三甲胺、三乙胺这两种有机溶剂，残留溶剂作为药物中的一类重要杂质，其残留水平高于安全阈值时，会对人体或环境产生危害[4]。因此，药物残留溶剂的检测及有效控制极其重要，本文建立了毛细管气相色谱顶空进样法测定阿维巴坦钠中三甲胺、三乙胺的残留，操作简便、重现性好、准确度高，可用于阿维巴坦钠原料药中三甲胺、三乙胺残留的测定。

1 仪器与试药

Agilent 7890A 气相色谱仪及工作站（FID 检测器），Agilent 7697A 顶空进样器。28%三甲胺溶液、三乙胺、二甲基亚砜、氢氧化钠均为分析纯，水为纯化水，载气为高纯氮气。

2 测定方法

2.1 色谱条件

以CP-Volamine 为固定液的毛细管柱为色谱柱（Agilent CP-Vlamine，30 m×0.32 mm，0.5 μm）；起始温度为40 ℃保持5 min，然后以15 ℃/min 的升温速率升温至180 ℃保持2 min，后运行程序：230 ℃维持5 min。进样口温度为200 ℃，FID 检测器温度为250 ℃，顶空平衡炉温90 ℃、进样针120 ℃、传输线140 ℃，平衡时间为30 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白溶液

精密量取0.1 mol/L NaOH 溶液0.2 mL，二甲基亚砜1.8～20 mL 顶空瓶中，摇匀密封，即得。

2.2.2 对照品溶液

精密称取28%三甲胺溶液、三乙胺各适量，用二甲基亚砜定量稀释制成每1 mL 中约含三甲胺10.5 μg、三乙胺32.0 μg 的溶液，作为对照品贮备液；精密量取1～10 mL 量瓶，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入二甲基亚砜溶解并定容，摇匀，精密量取2～20 mL 顶空瓶中，密封，备用。

2.2.3 供试品溶液

精密称取样品0.1 g，于10 mL 量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入二甲基亚砜溶解并定容，摇匀，精密量取2～20 mL 顶空瓶中，密封，即得。

2.2.4 溶剂定位溶液

精密称取28%三甲胺适量，用二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含10.5 μg 的溶液，作为三甲胺贮备液；精密称取三乙胺适量，用二甲基亚砜溶解并定量稀释制成每1 mL 中约含32.0 μg 的溶液，作为三乙胺贮备液；分别精密量取1～10 mL 量瓶，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入二甲基亚砜溶解并稀释定容，摇匀，精密量取2 mL 至20 mL 顶空瓶中，密封后备用。

2.2.5 供试品加标溶液

精密称取样品0.1 g 于10 mL 量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，加入对照品贮备液（按“2.2.2”项下配制）1 mL，用二甲基亚砜溶解并定容，摇匀，精密量取2～20 mL 顶空瓶中，密封，即得。

2.3 系统适用性试验

按“2.1”项下的色谱条件，取对照品溶液连续进样6 次，记录色谱图，三甲胺、三乙胺、二甲基亚砜之间的分离度均大于1.5，三甲胺、三乙胺峰面积的相对标准偏差分别为2.6%、1.9%，均小于10.0%，符合要求。

2.4 专属性试验

按“2.1”项下的色谱条件，取空白溶液、对照品溶液、三甲胺定位溶液、三乙胺定位溶液分别进样，记录色谱图，结果见图1，空白溶液在三甲胺、三乙胺保留时间处均无色谱峰，对目标溶剂的测定无干扰，该方法专属性良好。

2.5 检测限和定量限

取对照品溶液逐级稀释，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，信噪比约为3 时作为检测限溶液，并计算检测限；信噪比约为10 时作为定量限溶液，并计算定量限，结果见表1。

2.6 线性和范围

精密称取28%三甲胺、三乙胺各适量于不同的量瓶，分别用二甲基亚砜溶解并定量稀释制成浓度约为2.1 μg/mL 的三甲胺贮备液，浓度约为6.4 μg/ mL的三乙胺贮备液；精密量取三甲胺贮备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、7.5 mL 于10 mL量瓶，精密量取三乙胺贮备液0.4 mL、1.0 mL、2.5 mL、4.0 mL、5.0 mL、7.5 mL 于10 mL 量瓶，各加入0.1 mol/ L NaOH 溶液1 mL，用二甲基亚砜溶解并定容，摇匀，作为线性溶液。

取上述溶液，按“2.1”项下的色谱条件顶空进样，记录色谱图，分别以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，详见图1、图2。结果表明，三甲胺在0.209 4～1.570 4 μg/mL 浓度范围内，呈线性关系，回归方程为：y=21.1495x-0.243 1（R=0.999 6）；三乙胺在0.265 4～4.977 0 μg/ mL 浓度范围内，呈线性关系，回归方程为：y=14.931 8x+ 0.170 7（R=0.999 9），线性关系良好。

图2 三甲胺的标准曲线Fig.2 Standard curve of trimethylamine

图3 三乙胺的标准曲线Fig.3 Standard curve of triethylamine

2.7 精密度试验

分别平行配制6 份供试品加标溶液（按“2.2.5”项下配制），照“2.1”项下色谱条件测定，三甲胺峰面积的RSD 为1.3%（n=6）；三乙胺峰面积的RSD为1.8%（n=6），方法精密度良好。

2.8 溶液稳定性

按“2.1”项下色谱条件，取对照品溶液、供试品加标液分别在室温放置12 h，顶空进样测定，对照品溶液色谱图中，三甲胺峰面积的RSD 为1.8%，三乙胺峰面积的RSD 为2.5%；供试品加标液色谱图中，三甲胺峰面积的RSD 为2.2%，三乙胺峰面积的RSD为2.1%，说明对照品溶液、供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.9 准确度试验

按“2.2.2”项下配制3 份对照品贮备液；精密称取样品1.0 g 至10 mL 量瓶（9 份），分别加入对照品贮备液0.2 mL、1.0 mL、1.5 mL（每个浓度各3份），加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，用二甲基亚砜溶解并稀释定容，摇匀，精密量取2～20 mL 顶空瓶中，密封，作为回收率低、中、高溶液；另按照“2.2.3”项下配制3 份供试液，按“2.1”项下的色谱条件，分别取上述溶液进样测定，三甲胺平均回收率为96.0%，RSD=1.0%（n=9）；三乙胺平均回收率为96.3%，RSD=1.3%（n=9），准确度符合要求。

2.10 样品的测定

取本品3 批，按“2.1“项下的色谱条件分别测定，用外标法以峰面积计算三甲胺、三乙胺的残留量；结果表明，3 批次样品中均未检出三甲胺、三乙胺。采用本方法，能够准确地测定阿维巴坦钠原料药中的三甲胺、三乙胺。

3 讨论

3.1 耐用性

结合目标溶剂的性质及色谱柱特性，对比了DB-624 以及Agilent CP-Volamine 色谱柱，结果表明，DB-624 色谱柱检测目标溶剂峰形差，拖尾严重；Agilent CP-Volamine 柱检测峰形好，灵敏度高，且检测无干扰，故选择该毛细管柱作为分析色谱柱。通过改变初始柱温±5 ℃、流速±0.2 mL/min、进样口温度±5 ℃、检测器温度±5 ℃来考察方法的耐用性，结果表明，在上述各色谱条件微小波动下，各峰分离度符合要求，系统适用性符合要求，方法耐用性良好。

3.2 色谱条件的选择

本文论述的分析方法中，平衡温度的选择结合了样品中目标溶媒的沸点以及样品的热稳定性，并尽量避免了样品中挥发性热分析物对测定的干扰[5]。考虑到三乙胺的沸点较高为89.5 ℃，溶剂二甲基亚砜的沸点为189 ℃，本文检测方法选择90 ℃作为顶空平衡温度。

3.3 限度的制定

三甲胺残留限度的制定依据GB 2730—2015《食品安全国家标准腌腊肉制品》[6]中，三甲胺氮的限度为≤2.5 mg/100g，另，依据GB5009.179—2016《食品安全国家标准食品中三甲胺的测定》[7]折算出三甲胺的限度为≤10.5 mg/100 g，即105 ppm；三乙胺残留限度的制定依据ICH Q3C（R7）《杂质：残留溶剂的指导原则》[8]及《中国药典》2020年版四部通则《0861 残留溶剂测定法》[9]中，将三乙胺列为第三类溶剂，限度0.5%；结合EDQM，本文从严制定限度为3.2×10-4；从测定结果来看，三批样品中的三甲胺、三乙胺的残留量均符合限度要求。