SIRT3/FOXO3通路在肺癌A549细胞放疗抵抗中的作用机制研究

方庆亮，董昌盛，陈荣，龚卿，陆松，宋仁杰，顾香莲，王蕾，顾煜恺

（上海中医药大学附属龙华医院1.放疗科，2.中医肿瘤研究所，上海200032）

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，严重威胁人类生命健康。据统计，全球每年新增肺癌病死患者180 万例，发病率、病死率均居恶性肿瘤首位[1]。肺癌的治疗效果较差，早期肺癌患者经局部治疗后5年存活率＜55%[2]。但大部分肺癌患者确诊时已经处于晚期，5年生存率往往＜10%[3]。晚期的局部肺癌患者丧失了手术机会，放疗是首选的治疗手段之一，而放疗抵抗是导致5年生存率偏低的主要原因[4-5]。因此，深入探讨影响肺癌细胞放疗抵抗的因素和机制，提高放疗疗效，对改善肺癌患者5年生存率等预后指标具有重要临床价值。沉默信息调节因子3（Sirtuin 3,SIRT3）是重要的线粒体蛋白质，参与细胞凋亡、细胞代谢等生物学进程，与肿瘤关系紧密，参与多种癌症发生、发展[6]。叉头转录因子3（forkhead box O3,FOXO3）是一类进化保守的转录因子，具有调控细胞生长、凋亡等作用[7]。SIRT3/FOXO3 通路在肿瘤发生、发展中起重要作用[8]，但与肺癌放疗的关系尚不明确。本研究将探讨SIRT3/FOXO3 通路在肺癌A549细胞放疗抵抗中的作用机制，以期为提高放疗疗效提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

肺癌A549 细胞系（货号：DA-C5831）购自上海冠导生物工程有限公司，胎牛血清、蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白测定试剂盒、SIRT3 抗体、FOXO3抗体、GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（ 货号：S9030、BC3640、PT0001、K005158P、K001577P、M1000110、SR134）购自上海恒斐生物科技有限公司，青霉素、链霉素（货号：PPSJ-100247、PPSJ-100309）购自厦门慧嘉生物科技有限公司，DMEM 培养基、化学发光试剂盒（货号：ZY-P0032、ZY-11256）购自上海泽叶生物科技有限公司，胰蛋白酶、SIRT3 抑制剂（3-TYP）、CCK-8 试剂、AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（货号：SNM486-HMP、M07155-UKY、QN1293-OIR、WE0325-THR）购自北京百奥莱博科技有限公司，B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）抗体、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体（货号：CVL-PAB75275、GTX34421）购自北京孚博生物科技有限公司，培养箱（型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC）购自日本松下公司，全自动酶标仪（型号：ELX800）购自BIO-TEK 公司，流式细胞仪（型号：BD FACSCanto Ⅱ）购自美国BD 公司，化学发光成像系统（型号：ChemiDocXRS）购自美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞培养与分组

将A549 细胞置于含10%胎牛血清、100 u/ml 青霉素、0.1 mg/ml 链霉素的DMEM 培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合率达70%～80%时，使用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代。

取对数期A549 细胞，以1×105个/ml 的密度接种于96 孔培养板，每孔100 μl，实验分组如下：对照组（A549 细胞）、放疗组（A549 细胞+X 射线照射）、3-TYP 组（A549 细胞+50 μmol/L 3-TYP[9]），X 射线+3-TYP 组（A549 细胞+X 射线照射+50 μmol/L 3-TYP）。

照射方式[10]：室温条件下采用6 MV X 线照射A549 细胞，源皮距为100 cm，照射剂量为8 Gy，剂量率为300 cGy/min。

1.3 CCK-8法检测A549细胞增殖

4组A549细胞分别培养24 h、48 h、72 h 后加入CCK-8 试剂，继续培养2 h，使用全自动酶标仪（波长：450 nm）检测各孔吸光度（optical density,OD）值。

1.4 流式细胞术检测A549细胞凋亡及周期分布

48 h 后收集4 组A549 细胞，胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液洗涤3 次，使用400 μl 结合缓冲液制备细胞浓度为1×106个/ml 的细胞悬浮液，加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，避光孵育1 h，使用流式细胞分析仪测定细胞凋亡率。

48 h 后收集4 组A549 细胞，磷酸盐缓冲液洗涤，用预冷的70%乙醇固定1 h，磷酸盐缓冲液洗涤，用500 μ l RNase/PI 重悬细胞，避光染色20 min，使用流式细胞分析仪检测细胞周期分布情况。

1.5 Western blotting 检测SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量

48 h 后收集4 组A549 细胞，用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA 蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。依次进行电泳分离、转膜、封闭，加一抗（1∶500稀释的SIRT3抗体、FOXO3抗体、Bcl-2 抗体、Bax 抗体和1∶1 000 稀释的GAPDH 抗体）4℃孵育过夜，TBST 洗涤，加二抗（1∶1 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G）室温孵育1 h，化学发光法显色，Tanon 600 图像分析系统拍摄图像，以GAPDH 为内参，分析SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 统计学软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步的两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组A549细胞增殖情况

各组A549 细胞培养24 h、48 h、72 h 的OD 值比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的A549 细胞OD 值比较，差异有统计学意义（F=63.098，P=0.000）；②不同组间的A549 细胞OD 值比较，差异有统计学意义（F=82.092，P=0.000）；③各组A549细胞OD值变化趋势比较，差异无统计学意义（F=1.440，P=0.215）。见图1和表1。

图1 各组A549细胞OD值变化趋势

表1 各组不同时间点A549细胞OD值比较 （n=6，±s）

表1 各组不同时间点A549细胞OD值比较 （n=6，±s）

组别对照组放疗组3-TYP组X射线+3-TYP组24 h 0.35±0.07 0.15±0.04 0.47±0.09 0.23±0.06 48 h 0.49±0.10 0.24±0.07 0.64±0.11 0.36±0.09 72 h 0.73±0.13 0.40±0.09 0.94±0.15 0.55±0.11

2.2 各组A549细胞凋亡情况

对照组、放疗组、3-TYP 组和X 射线+3-TYP组A549 细胞凋亡率分别为（24.62±7.28）% 、（60.94±13.43）% 、（13.72±5.06）% 和（39.57±11.05）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=26.326，P=0.000）。放疗组、X 射线+3-TYP 组较对照组升高（P＜0.05），3-TYP 组较对照组降低（P＜0.05），3-TYP 组、X 射线+3-TYP 组较放疗组降低（P＜0.05），X 射线+3-TYP 组较3-TYP 组升高（P＜0.05）。见图2、3。

图2 各组A549细胞凋亡情况

图3 各组A549细胞凋亡率比较 （n=6，±s）

2.3 各组A549细胞周期分布情况

各组A549 细胞周期分布情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05），放疗组、X射线+3-TYP组G0/G1期A549 细胞较对照组增加（P＜0.05），S、G2/M 期A549 细胞较对照组减少（P＜0.05）；3-TYP 组G0/G1期A549细胞较对照组减少（P＜0.05），S、G2/M 期A549 细胞较对照组增加（P＜0.05）；3-TYP 组、X 射线+3-TYP 组G0/G1期A549 细胞较放疗组减少（P＜0.05），S、G2/M 期A549 细胞较放疗组增加（P＜0.05）；X 射线+3-TYP 组G0/G1 期A549 细胞较3-TYP 组增加（P＜0.05），S、G2/M 期A549 细胞较3-TYP 组减少（P＜0.05）。见表2 和图4、5。

表2 各组A549细胞周期分布比较 （n=6，%，±s）

表2 各组A549细胞周期分布比较 （n=6，%，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与放疗组比较，P ＜0.05；③与3-TYP组比较，P ＜0.05。

组别对照组放疗组3-TYP组X射线+3-TYP组F 值P 值S G0/G1 49.16±4.52 68.73±6.57①42.05±4.16①②27.66±4.25 17.51±3.29①33.59±4.48①②G2/M 20.14±3.36 12.03±2.15①24.66±3.55①②58.01±5.36①②③22.25±3.74①②③15.95±2.97①②③18.990 0.001 29.067 0.000 18.336 0.001

图4 各组A549细胞周期分布情况

图5 各组A549细胞周期分布 （n=6，±s）

2.4 各组A549 细胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较

各组A549 细胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。放疗组、X射线+3-TYP组A549细胞SIRT3、FOXO3、Bax蛋白相对表达量较对照组升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相对表达量较对照组降低（P＜0.05）；3-TYP 组A549 细胞SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相对表达量较对照组降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相对表达量较对照组升高（P＜0.05）；3-TYP 组、X 射线+3-TYP 组A549 细胞SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相对表达量较放疗组降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相对表达量较放疗组升高（P＜0.05）；X 射线+3-TYP 组A549 细胞中SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相对表达量较3-TYP 组升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相对表达量较3-TYP 组降低（P＜0.05）。见图6、7 和表3。

图6 各组A549细胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白表达

图7 各组A549细胞SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 （n=6，±s）

表3 各组A549细胞中SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 （n=6，±s）

表3 各组A549细胞中SIRT3、FOXO3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 （n=6，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与放疗组比较，P ＜0.05；③与3-TYP组比较，P ＜0.05。

组别对照组放疗组3-TYP组X射线+3-TYP组F 值P 值Bax/GAPDH 0.28±0.08 0.85±0.16①0.15±0.04①②0.49±0.34①②③15.028 0.000 SIRT3/GAPDH 0.33±0.08 0.86±0.23①0.24±0.05①②0.52±0.12①②③23.714 0.000 FOXO3/GAPDH 0.26±0.07 0.81±0.25①0.17±0.04①②0.48±0.13①②③22.668 0.000 Bcl-2/GAPDH 0.62±0.17 0.23±0.07①0.87±0.21①②0.41±0.12①②③19.768 0.000

3 讨论

肺癌局恶性肿瘤死亡率得第1 位，其中85%的肺癌为非小细胞肺癌。放疗是利用大量放射线破坏细胞DNA，以阻碍细胞增殖，其在快速生长分裂的癌细胞中效果更为显著，是非小细胞肺癌的重要治疗手段之一[11]。有研究表明，早期无法手术的非小细胞肺癌患者放疗效率较高，接受放疗后的2年、5年局部控制率分别为97.6%和93.0%，3年、5年生存率分别为55.0%和40.0%[12]。但绝大多数肺癌患者确诊时已处于晚期，临床治疗时出现放疗抵抗，是常见的失败原因[13]。因此，研究肺癌细胞放疗抵抗的作用机制，对增强放疗敏感性具有重要意义。

Sirtuin 家族是第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，通过去乙酰化作用参与氧化途径，进而影响细胞的多种生物学进程[14]。SIRT3 是Sirtuin 家族成员之一，是线粒体内最主要的去乙酰化酶，其缺失会导致肿瘤细胞内活性氧增加。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）稳定，其靶基因表达增强，从而促进肿瘤发生、发展[15]。陈祥等[16]研究表明，SIRT3 可能通过Bax 凋亡信号通路抑制肝癌细胞生长。本研究结果显示，与对照组相比，放疗组A549 细胞OD 值降低、细胞凋亡率升高，3-TYP 组A549 细胞OD 值升高、细胞凋亡率降低，提示放疗可以抑制A549 细胞增殖并诱导其凋亡，抑制SIRT3 表达可以促进A549 细胞增殖并抑制其凋亡。

细胞增殖、凋亡过程与细胞周期变化有关[17]。本研究结果显示，与对照组相比，放疗组G0/G1 期A549 细胞增加，S、G2/M 期A549 细胞减少，3-TYP组G0/G1期A549细胞减少，S、G2/M 期A549 细胞增加，提示放疗可能促进A549 细胞由S、G2/M 期进入G0/G1 期，并将细胞周期阻滞于G0/G1 期，发挥抑制增殖、诱导凋亡作用；抑制SIRT3 表达可能通过调控细胞周期促进A549 细胞增殖，抑制其凋亡；与放疗组相比，X 射线+3-TYP 组G0/G1 期A549 细胞减少，S、G2/M 期A549 细胞增加，提示抑制SIRT3 表达可以促使放疗后的A549 细胞脱离G0/G1期，进入S 期完成细胞周期，使A549 细胞发生放疗抵抗。

FOXO3 是一种转录因子，在细胞生长、凋亡、能量代谢等过程中均发挥重要作用[8，18]。据报道，FOXO3 能够在细胞核内结合其靶基因，调控基因转录过程，影响细胞生物学特性[19]。FOXO3 是一种抑癌因子，具有磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化等多种化学修饰作用，其磷酸化产物可抑制其转录活性，促进转移、降解，从而抑制其抗肿瘤作用[20]。羊丽丽等[21]研究表明，静息状态下FOXO3呈磷酸化水平，受外界刺激后脱磷酸化，诱导Bim等促细胞凋亡蛋白表达，发挥抗肿瘤作用。卢丽琴等[22]研究表明，FOXO3 可被SIRT3 激活发生去乙酰化，进而减少活性氧的产生，发挥抗氧化作用，调控肿瘤发生、发展。Bcl-2、Bax 分别为Bcl-2 家族的抑凋亡成员和促凋亡成员[23]。本研究结果显示，放疗组A549 细胞中SIRT3、FOXO3、Bax 蛋白相对表达量较对照组升高，Bcl-2 相对表达量较对照组降低，提示放疗可通过上调Bax 表达、下调Bcl-2 表达从而促进A549 细胞凋亡，且这一过程伴随SIRT3、FOXO3 蛋白相对表达量变化。进一步研究显示，X 射线+3-TYP 组A549 细胞中SIRT3、FOXO3 蛋白相对表达量较放疗组降低，提示SIRT3受抑制后FOXO3 表达随之降低，FOXO3 的表达可能受SIRT3 调控，且SIRT3、FOXO3 蛋白相对表达量降低可能与A549 细胞发生化疗抵抗有关。推测激活SIRT3/FOXO3 通路将有助于提高肺癌A549 细胞对放疗的敏感性，抑制A549 细胞增殖并促进其凋亡，为减少放疗抵抗提供一个新的研究思路和治疗方法。

综上所述，SIRT3/FOXO3 通路受抑制后，放疗对肺癌A549 细胞的抑制增殖、促进凋亡作用减弱，SIRT3/FOXO3 通路可能与肺癌A549 细胞放疗抵抗有关，可进一步研究SIRT3/FOXO3 通路激活后对肺癌A549 细胞放疗抵抗的影响，为临床放疗中减少抵抗提供参考。