肺炎支原体肺炎患儿外周血单个核细胞TIPE2的表达及与Th17/Treg平衡的相关性

张骞，侯瑞霞，张超，张燕霞

（济南市第二妇幼保健院1.儿科，2.药剂科，山东济南271199）

近年来，肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）发病率呈上升趋势[1-2]。MPP 是常见小儿肺炎，临床症状主要为发热、咳嗽、咽痛、头痛等。大量研究发现，MPP 发病机制与肺炎支原体入侵呼吸道上皮细胞、患儿免疫系统功能紊乱有关[1-2]。TIPE2 是一种新型免疫调节蛋白，可参与多种炎症性疾病的发展。以往研究证实TIPE2 对免疫细胞具有促分泌作用，在小儿哮喘中发挥重要作用[3-4]。辅助性T 细胞17（helper T cell,Th17）、调节性T 细胞（regulatory T cells,Treg）是两种重要的免疫细胞类型，可分泌相应细胞因子。有研究提示Th17/Treg 比例失调可能与支原体肺炎患儿病情发生、发展有关[5-7]。因此，本研究通过检测MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2 水平，分析其与Th17/Treg 平衡的关系，初步探究其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年9月—2020年9月济南市第二妇幼保健院收治的MPP 急性发作期患儿和恢复期患儿各104 例作为研究对象。其中，急性发作组男性50 例，女性54 例；年龄1～11 岁，平均（5.19±2.47）岁。恢复组男性61 例，女性43 例；年龄1～10 岁，平均（5.37±2.01）岁。随机纳入同期本院健康体检儿童90 例为对照组。其中，男性48 例，女性42 例；年龄1～10 岁，平均（5.26±1.92）岁。对照组儿童均无呼吸系统疾病及其他系统疾病，排除近2 周合并感染史、用药史儿童。3 组研究对象年龄、性别构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准同意。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准①符合中华医学会儿科学分会呼吸学组发布的《儿童肺炎支原体肺炎诊治专家共识（2015年版）》[8]相关诊断标准；②患儿年龄≤12 岁；③临床资料完整，患儿家属均知情并自愿签署知情同意书。

1.2.2 排除标准①其他呼吸系统疾病；②合并心、肝、肾、肺等发育不全或功能不全；③合并血液系统疾病患者；④营养不良；⑤其他原因引起的喘息、咳嗽、发热等或近期发生过呼吸道感染疾病。

1.3 方法

1.3.1 血标本采集收集入院次日MPP 患儿及健康体检儿童清晨空腹静脉血4 ml，平均分装于2 个试管中，其中一只试管为抗凝管，加入人淋巴细胞分离液后分离得到单个核细胞，置于-80℃冷冻保存待测。另一只试管为非抗凝试管，2 000 r/min离心15 min，取上清液置于-80℃保存待测。

1.3.2 实验室检测采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测外周血单个核细胞TIPE2，人TIPE 试剂盒购自上海谷研实业有限公司。将分离后的单个核细胞用洗涤液洗涤2 次后重悬于10% FCS RPMI 1640 培养液，荧光标记染色，充分震荡后再次洗涤2 次，加固定液，染色，制片，荧光显微镜下观察。采用流式细胞术检测Th17、Treg，ELISA 检测白细胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）、白细胞介素-35（Interleukin-35,IL-35）、C 反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、降钙素原（Procalcitonin,PCT）水平。人IL-17、人IL-35 试剂盒购自北京百奥莱博生物有限公司，人CRP、人PCT 试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司。均严格按照试剂盒说明书步骤进行检测。

1.3.3 肺功能检测利用FGC-A+型全自动肺功能检测仪检测MPP 患儿肺功能，包括第一秒用力呼气量（forced expiratory volume in first second,FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、呼气流量峰值（peak expiratory flow,PEF）。

1.4 观察指标

比较急性发作组、恢复组MPP 患儿和对照组健康儿童外周血单个核细胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg 及血清IL-17、IL-35、CRP、PCT 水平；比较急性发作组、恢复组MPP 患儿肺功能指标；分析MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2 与Th17、Treg、Th17/Treg、血清IL-17、IL-35、CRP、PCT的相关性；分析影响MPP 发生的危险因素。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；相关性分析用Pearson 法；影响因素的分析采用多因素Logistic回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组外周血单个核细胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指标比较

急性发作组、恢复组与对照组外周血单个核细胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg、TL-17、IL-35、CRP、PCT 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，恢复组、急性发作组MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2、Treg、IL-35 降低（P＜0.05），Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 升高（P＜0.05）；与恢复组比较，急性发作组MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2、Treg、IL-35 降低（P＜0.05），Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 升高（P＜0.05）。见表1。

表1 3组外周血单个核细胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指标比较 （±s）

表1 3组外周血单个核细胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指标比较 （±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与恢复组比较，P ＜0.05。

组别急性发作组恢复组对照组F 值P 值n 104 104 90 TIPE2/（pg/ml）28.76±4.17①②42.08±6.34①53.24±8.13 364.251 0.000 Th17/%2.89±0.57①②2.13±0.40①1.29±0.21 338.250 0.002 Treg/%3.16±0.49①②4.22±0.64①5.45±0.83 291.034 0.000 Th17/Treg 0.92±0.18①②0.51±0.13①0.24±0.09 582.865 0.000组别急性发作组恢复组对照组F 值P 值PCT/（μg/L）0.20±0.06①②0.13±0.03①0.05±0.02 320.823 0.000 IL-17/（pg/ml）163.14±37.24①②147.33±25.06①138.14±23.29 18.077 0.000 IL-35/（pg/ml）156.81±39.74①②220.67±57.82①314.11±76.15 172.920 0.000 CRP/（mg/L）23.61±6.42①②9.25±2.87①4.17±1.63 558.022 0.000

2.2 急性发作组和恢复组MPP 患儿肺功能指标比较

急性发作组与恢复组患儿FEV1、FVC、PEF比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），急性发作组FEV1、FVC、PEF 低于恢复组。见表2。

表2 急性发作组和恢复组MPP患儿肺功能指标比较（n=104，%，±s）

表2 急性发作组和恢复组MPP患儿肺功能指标比较（n=104，%，±s）

组别急性发作组恢复组t 值P 值FEV1 62.63±10.48 86.52±16.37 12.534 0.000 FVC 79.22±9.64 94.62±16.37 8.267 0.000 PEF 64.92±9.13 87.81±10.16 17.089 0.000

2.3 MPP患儿外周血单个核细胞TIPE2与各指标的相关性分析

MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2 与Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 呈负相关（P＜0.05），与Treg、IL-35 及FEV1、FVC、PEF 呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表3 MPP患儿血清外周血单个核细胞TIPE2与各指标的相关性分析

2.4 影响MPP的危险因素

以是否发生MPP 为因变量（1=是，0=否），将外周血单个核细胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg 及血清IL-17、IL-35、CRP、PCT 等连续变量纳入自变量。一般多因素Logistic 回归分析结果显示，和（95% CI：1.047，2.439）]是影响MPP 发生的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响MPP发生危险因素的多因素Logistic回归分析参数

3 讨论

MPP 好发于幼儿群体，与幼儿尚处于生长发育阶段，呼吸系统发育不成熟、免疫力低下有关[9]。引起幼儿发生肺炎的主要原因是病原体感染，肺炎支原体是较常见肺炎病原体微生物，长期炎症浸润可导致患儿血管内皮损伤、炎性变态反应及凝血系统异常，若未及时就医或治疗效果差，极有可能发展为重症肺炎，严重影响患儿生命健康。探究MPP 发病机制有利于针对性治疗MPP 患儿。

TIPE2 属于TNFAIP8 家族一员，是一种新的先天性和适应性免疫应答的负调控因子，通过与Caspase-8 结合抑制激活蛋白-1 和核因子κB 的活性，促进脂肪酸合成酶Fas 诱导的免疫细胞凋亡[10-11]。本研究结果显示，MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2 水平明显低于对照组儿童，且急性发作期MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2 水平明显低于恢复期患儿，表明TIPE2 水平可能反映MPP 的发生、发展，其具体分子机制尚不清楚。SHI 等[12]报道称，TIPE2 不仅能维持免疫稳态，而且能调节炎症反应，TIPE2 受T 细胞受体和Toll 样受体的激活作用，调控其下游靶信号通路，通过调节多种免疫细胞活性及功能参与哮喘的发病机制。ZHANG 等[13]研究发现，支原体肺炎感染患者外周血单个核细胞TIPE2 mRNA表达明显降低，且与患者感染严重程度有关；进一步体外研究发现，TIPE2 通过抑制MAPK信号通路，负调控肺炎支原体感染诱导的炎症细胞因子水平，进而参与MPP 的发生、发展，与本研究结果一致。本研究结果显示，MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2 与IL-17 等炎症因子呈负相关，提示TIPE2 可能通过调控炎症信号通路参与MPP 的发生机制，其具体作用方式有待更深入研究。

Th17 细胞是新近发现的一类CD4+T 细胞亚群，由于该细胞亚群可特异性分泌IL-17 而被命名为Th17 细胞。有研究证实，Th17 细胞具有较强的促炎作用，由IL-6 和转化生长因子-β 共同诱导Th 细胞分化而来[14-15]。多项研究显示，IL-17 可参与多种自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、关节炎等[16-17]。Treg 是一类具有免疫调节功能的T 细胞亚群。ROMANO 等[18]研究发现，Treg 通过分泌细胞介质抑制T 细胞及抗原传递功能，并降低炎症细胞因子及抗体水平来发挥免疫效应。国内有学者报道，MPP 患儿外周血Th17 细胞增多，Treg 细胞减少，Th17/Treg 比例失衡，且两者各自分泌的细胞因子表达异常，可能在MPP 发生、发展中发挥重要作用[19]，与本研究结果一致。本研究结果显示，与对照组比较，MPP 患儿外周血Th17 升高，Treg 降低，Th17/Treg 比值升高，表明MPP 患儿病情发生、发展与免疫细胞代谢紊乱、稳态失衡有关。Treg 细胞是维持自我耐受，防止过度炎症和自身免疫性疾病所必需的[19]。LI 等[20]研究发现，FOXP3 是Treg 细胞的特异性标志物，对Treg 的生长分化及功能完善起至关重要的作用，FOXP3基因缺失小鼠常伴随致命的自身免疫疾病、肠道病变、皮屑病等。由此可知，Th17 细胞与Treg 细胞相互作用、相互制约，共同维持机体免疫稳态，若Th17/Treg 平衡被打破，则可能发生炎症因子浸润，机体产生严重炎症反应，这可能是MPP 发生的分子机制之一。

本研究通过检测MPP 患儿肺功能指标发现，急性发作组MPP 患儿FEV1、FVC、PEF 均明显低于恢复组患儿，表明MPP 患儿肺功能异常，出现阻塞性通气障碍。CRP、PCT 是诊断MPP 的常用指标，当机体被感染时，CRP 作为急性期蛋白具有较高的敏感性，CRP、PCT 在短时间内迅速上升[21]。Pearson 相关性分析结果显示，TIPE2 与Th17、Th17/Treg、CRP、PCT 呈负相关，与Treg、IL-35、FEV1、FVC、PEF 呈正相关，表明TIPE2 可能反映MPP 患儿肺功能状况，其水平变化与MPP 患儿免疫状态、病情严重程度有关。一般多因素Logistic 回归分析结果显示，TIPE2、Th17/Treg、IL-17 是影响MPP 发生的独立危险因素，表明TIPE2 水平降低、Th17/Treg 失衡加大MPP发生的风险。

综上所述，MPP 患儿外周血单个核细胞TIPE2水平明显低于健康儿童，急性发作期患儿TIPE2 水平低于恢复期，Th17 增加，Treg 减少，Th17/Treg平衡被破坏，其水平变化与MPP 患儿肺功能有关，可能作为MPP 发生的潜在生物学指标。本研究在观察指标及研究对象上尚存不足，如观察对象较少导致结果可能发生偏倚，未考虑到不同病情程度患儿各项指标的变化，同时还需在下一步研究中扩大研究范围，随访分析患儿治疗前后各因子水平的变化，为临床治疗提供依据。