肉鸡源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

2021-07-02吉尚雷刘立英侯春雪

现代畜牧兽医 2021年6期

吉尚雷，刘欣，2，刘立英，侯春雪，2，万玲 *

（1. 辽宁农业职业技术学院，辽宁营口115009；2. 北京大伟嘉生物技术股份有限公司，北京100085）

鸡白痢沙门氏菌病最易感染3 周龄内的雏鸡，能够引起雏鸡排白色稀粪，因呼吸困难或急性败血症而死亡，病死率较高[1-2]。成年鸡主要感染生殖系统[3]，导致产蛋率下降、种蛋的受精率、孵化率及健雏率降低，严重时可引起死亡。鸡白痢沙门氏菌病可进行水平传播，也可通过种鸡蛋垂直传播[4]。近年来，鸡白痢沙门氏菌的防控措施已经十分完善，发病情况呈下降趋势。但是，由于抗生素使用的不规范，导致耐药菌株不断出现，不同地区耐药性不尽相同，严重影响养鸡业的健康发展[5-6]。

2019年9月至12月，从辽南地区多家疑似感染鸡白痢沙门氏菌的肉鸡养殖场采集样品进行实验室检测，分离得到1株细菌，通过病原分离鉴定确定为沙门氏菌，并进行药敏试验，为该病的有效防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料

病料采自辽南地区某肉鸡场10日龄发病雏鸡的小肠、肝脏组织。

1.1.2 试验试剂

HE 琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）购自青岛海博生物技术有限公司；药敏试纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；染色液及其他常规试剂由辽宁动物健康养殖研究中心实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离培养

无菌操作分别采集病雏鸡的小肠、肝脏组织1 g，加入到10 mL 亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，37 ℃培养12 h，用于沙门氏菌选择性增菌培养。用接种环蘸取菌液并在HE琼脂培养基上进行划线，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 细菌生化试验

挑取单个菌落，接种于生化反应管中，37 ℃孵育48 h后观察结果。

1.2.3 PCR反应

按照DNA 提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，采用已发表的16S rRNA 通用引物，引物序列为：8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1540R：5'-AAGGAGG TGATCCAGCCGCA-3'，对分离菌株 16S rRNA 基因进行扩增，预期扩增DNA片段大小约为1 500 bp。

PCR 反应体系30 μL：2×PCR Mix 3.0 15 μL、DNA 模板2 μL、上下游引物各2 μL、无菌水9 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃、10 min，变性94 ℃、5min，退火55 ℃、1 min，延伸72℃、1 min，35个循环，最后延伸72 ℃、10 min。

PCR 扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，PCR 产物测序后在Gen Bank 数据库中进行BLAST 比对，进一步确定分离菌株的种类。

1.2.4 药敏试验

采用纸片扩散法测定分离株对各药物的敏感性。挑取将纯培养的菌落放入营养肉汤中增菌，均匀涂布于培养基表面，在培养基表面放置药物纸片，纸片之间距离2 cm，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径大小，判定对不同药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养与染色镜检结果（见图1、图2）

由图1 可知，在病死鸡的肠道分离到一株细菌，在HE琼脂培养基上长出黑色菌落。

图1 分离菌在HE琼脂生长特性Fig.1 Growth morphology of isolate on HE medium

由图2 可知，革兰氏染色镜检可见两端钝圆的红色短小阴性杆菌，初步鉴定为沙门氏菌。

图2 分离菌革兰氏染色镜检结果Fig.2 Morphology of isolate under the microscope

2.2 细菌生化试验结果

分离菌株可以发酵葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇，不发酵乳糖、蔗糖、麦芽糖。吲哚试验和V-P试验呈阴性反应，甲基红试验为阳性，符合沙门氏菌的生化特性。

2.3 分离菌PCR鉴定结果（见图3）

由图3 可知，提取分离菌基因组DNA 作为模板，利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增[7]，电泳检测目的条带大小与预期一致。测序后获得目的片段大小为1 448 bp，将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，结果显示分离菌株与基因库收录的其他沙门氏菌菌株序列同源性在98%以上，确定分离菌株为沙门氏菌。

图3 细菌PCR扩增结果Fig.3 The PCR result of isolated strain

2.4 分离菌药敏试验结果（见表1）

由表1可知，该菌株对阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星高度敏感；对庆大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、四环素中度敏感；对青霉素、氨苄西林、万古霉素、克林霉素耐药。

表1 分离菌药敏试验结果Tab.1 Drug susceptibility test results of isolated strain

3 讨论

沙门氏菌是1种人畜共患的细菌性疾病，约有2 500种血清型[8]。在世界范围内，人类因食用含有沙门氏菌的禽类食品而引起中毒的事件时有发生[9]。对家禽产业影响最严重的是鸡白痢沙门氏菌[10]。目前，针对沙门氏菌，净化是最普遍的技术手段[11]。在欧洲，主要通过综合控制养殖场、屠宰场和食品加工厂，实施畜禽监控、淘汰感染动物等一系列具体措施，来减少养殖业中的沙门氏菌[12]。受养殖规模、养殖品种、饲养管理、环境变化、免疫选择等多种因素影响，我国家禽沙门氏菌病年年发生[13]。辽南地区养鸡业在全省占有较大比重，散养户和中小型养殖场占较大比重。部分养殖户为降低成本、增加利润，大量使用抗生素，导致鸡白痢沙门氏菌不断变异产生耐药株。

本试验对辽南地区疑似鸡白痢沙门氏菌感染的病死雏鸡进行检测，最终确定分离菌为鸡白痢沙门氏菌。本研究利用12 种抗生素进行药敏试验，分离细菌对阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星高度敏感；对庆大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、四环素中度敏感；对青霉素、氨苄西林、万古霉素、克林霉素耐药。不同地区分离出的沙门氏菌耐药性不尽相同，可能与抗生素的种类、使用方法、药浓度、使用次数等有关[14]。因此，临床上应该根据药敏试验结果筛选的高度敏感药物进行治疗，并且制定科学合理的药物使用制度，避免耐药菌株的产生[15]。