环境水样中总磷分析方法及仪器的研究进展

许 金，袁东星，王 婷，陈洛丹

(1.厦门大学 环境与生态学院，福建 厦门 361102；2.桂林电子科技大学 教学实践部，广西 桂林 541004)

磷是生物不可或缺的营养元素之一，是基本生化物质的重要组成部分。作为生态系统的主要限制性因子[1]，磷直接参与或间接控制了许多其他元素的生物地球化学循环[2]。

1 水体中的总磷

1.1 磷的存在形态与总磷定义

水体中所有形态磷的总和称为总磷(TP)，可分为4类：溶解态无机磷(DIP)、溶解态有机磷(DOP)、颗粒态无机磷(PIP)和颗粒态有机磷(POP)。根据操作过程定义[3]，水体中能通过孔径为0.45 μm滤膜的磷称为总溶解态磷(TDP)，其包括DOP和DIP；被滤膜截留的POP和PIP为总颗粒态磷(TPP)。

根据化学反应对总磷进行划分[4]，水样未经过滤直接使用标准磷钼蓝(PMB)分光光度法测得的磷为总活性磷(TRP)；添加硫酸水解后，经PMB法测定的磷包括TRP和总可酸解磷(TASP)，总磷扣除这部分磷即为总有机磷(TOP)。水样经过滤后，使用PMB法测定的磷为可溶性活性磷(SRP)，其余部分为可溶性非反应性磷(SNP)。水中SRP主要由DIP组成，在远离大陆的远洋海域，一般认为SRP浓度近似等于DIP浓度；水中SNP可通过TDP扣除SRP获得。水样中磷的分类见图1。

图1 根据操作定义和化学反应的水样中磷的分类Fig.1 Operational and chemical classification of phosphorus in water samples

1.2 地表水中的总磷

近几十年，随着工业、农业及城市化的发展，氮、磷等营养元素过量输入天然水体，导致水体富营养化、生态系统退化、有害藻类大量繁殖以及水域底部缺氧，造成严重的水环境问题[5-6]。2000年，我国七大重点流域地表水劣Ⅴ类占13.8%，主要淡水湖泊的富营养化问题突出，总氮、总磷及高锰酸盐指数为主要污染指标[7]；至2010年，全国地表水污染持续加重，劣Ⅴ类上升至16.4%，26个国控重点湖泊(水库)中劣Ⅴ类达10个(38.5%)，地表水的主要污染指标为总氮和总磷[8]；截至2020年12月，国内主要流域、湖泊及水库的水生生态系统得到有效恢复，1 940个水质断面中劣Ⅴ类断面降至1.0%，主要污染指标为化学需氧量、高锰酸盐指数和总磷[9]。由我国近20年来的水环境质量报告可知，总磷一直是地表水的主要污染指标。另有研究表明，地表水体富营养化的发生率和严重程度与水体的径流量、水深、浊度、温度、光照情况以及碳、氮、硅、磷等元素的含量和比例有关，而总磷浓度是最关键的因素[10]。

1.3 海水中的总磷

在海洋环境中，DIP是最大的溶解磷库，直接影响着浮游植物的生长、丰度、分布和多样性[11]。在某些海域，如北大西洋的西部海域[12]和东地中海[13]，DIP已成为初级生产力的最终限制性因素。DIP还可能影响海洋氮储库的收支平衡[14]。海水中DOP大致分为两大类有机化合物：含C-O-P键的磷酸酯和含C-P键的膦酸酯[15]。由于DOP的复杂性和当前TP、TDP测定方法的局限性，DOP的动力学过程、对海洋生态系统和初级生产力的详细贡献等尚不明确。

1.4 工业用水中的总磷

随着工业生产的迅速发展，工业用水量也日益增加。据统计，2005～2019年每年我国工业用水量占总用水量的20.2%～24.1%[16]，是除农业以外最大的用水行业。在工业用水中，循环冷却水用水量最大[17]。冷却水在循环使用过程中不断浓缩，矿物质浓度升高，易引起冷却系统及设备管道结垢、腐蚀[18]。目前最常用的处理方法是在水中添加一定浓度的缓蚀阻垢剂，以阻止不溶性沉淀物(水垢)的形成，减缓管道和设备的结垢及腐蚀[19]。磷系缓蚀阻垢剂，如羟基乙叉二膦酸、胺基三甲叉膦酸和膦酰基丁烷三羧酸等有机膦酸，在国内外工业领域是应用范围最广、防腐效果最好的一类水处理剂[20-21]。在工业领域，通常以水样中总磷浓度间接反映循环冷却水中的有机膦酸浓度。

2 总磷的主要分析方法

水体中总磷包含溶于水及附着于细菌、胶体、浮游动植物等固体颗粒表面的各种形态磷，即TP=DIP+DOP+PIP+POP。因此，总磷测定通常分两步进行：①使用某种消解方法将水样中各种不同形态的磷转化为可被检测的磷酸盐；②测定消解后样品中的磷酸盐浓度。

2.1 总磷的主要消解方法

2.1.1硫酸-硝酸消解法硫酸-硝酸消解法是美国水和废水分析标准[22]建议的消解方法之一。Kovar等[23]指出，在足够长的消解时间下，硫酸-硝酸消解法可将几乎所有形式的含磷化合物转化为磷酸盐。但该方法存在试剂空白较高、样品间易交叉污染和重现性差等问题[24]。此外，该方法操作复杂，加热的消解液可能会从凯氏烧瓶中逸出，造成一定安全隐患。因此，硫酸-硝酸消解法近年来应用和相关研究较少。

2.1.2干法灰化法Solórzano等[25]将常用于沉积物总磷测定的干法灰化法[26]改进为硫酸镁-干法灰化-盐酸消解法，用于分析地表水中的总磷。该法消解效率较高，15种不同种类的含磷化合物回收率均在95%～103%之间。由于该法需对样品进行干燥、灰化等处理，多被用于测定水体的TPP浓度[27-28]。Labry等[29]详细论述了河口和沿海海域样品中有机和无机颗粒态磷的几种常用消解方法，列举大量证据表明Solórzano等人改进的干法灰化法是水体TPP测定的最佳方法。但该法操作较繁琐。

2.1.3微波辅助消解法微波辅助消解法是近年发展起来的样品前处理方法，其优点是样品消解效率高[30]。Maher等[31]比较了微波辅助消解和高温高压消解在测定湖泊浑浊水样中总磷的应用，两种方法的结果无显著差异，但前者所需的温度较低，时间较短。此外，微波辅助消解可使水样在相对不高的压力下加热至较高温度，有利于构建常压型在线快速消解器[32]。Almeida等[33]将家用微波炉改装为微波在线消解器，结合多注射泵流动分析技术和分光光度法建立了水样中总磷的在线分析系统，样品通量可达12样/h，并成功用于生活废水中总磷的测定。微波辅助消解法已被确立为一种常规且完善的样品制备方法[34]，但需要专门的微波发生装置，体积大、功耗高，较难在现场应用。

2.1.4过硫酸钾-高温高压消解法Menzel等[35]于1965年首次提出过硫酸钾-高温高压消解法，其操作简单、消解快速、重现性好，且全程密封，可最大限度地减少样品间交叉污染[36]。该方法已被列为我国废水、地表水和海水等各类水样总磷实验室测定的国家标准消解方法[37-38]，同时也是美国公共卫生协会[22]和环境保护局[39]推荐的样品前处理方法。根据消解试剂的酸碱性，过硫酸钾-高温高压消解法分为酸性法、中性法和碱性法。

Gales等[40]开发的酸性法已被美国环境保护局[39]采纳，广泛应用于降雨[41]、土壤径流[42]、湖泊及河流[43-44]等地表水样品的总磷监测。Koroleff[45]指出，若先将样品酸化，消解剂过硫酸钾的体积分数可从1%降至0.3%。但酸性法的样品消解后pH值降低，不利于随后的PMB显色反应[46]。因此，研究者建议，使用PMB分光光度法测定消解后的总磷时有必要调节样品pH值[47-48]。

中性法是我国总磷测定标准方法[37-38]推荐的消解法，其可避免酸性法对PMB显色的影响。但由于缩聚磷酸盐通常需在酸性条件下经较长时间氧化才能水解为正磷酸盐，因此缩聚磷酸盐在中性法下的消解效率较低[36]，可能使水体总磷浓度被低估[49]。

2.1.5UV光氧化法UV光氧化是一种新兴消解技术。UV-C光谱区域(220～290 nm)的辐射能破坏化学键，常被用于杀菌消毒和光氧化[52]。UV光氧化效率依赖于产生的强氧化自由基数量[53]，可加入化学氧化剂作为自由基发生剂，如过氧化氢、臭氧、过硫酸盐、Fenton试剂等，以提高光氧化效率。

UV光氧化法易结合流动分析技术构成在线消解器，实现快速、实时、在线的样品消解。Tong等[54]提出了一种总磷分析的热辅助光催化消解法，以纳米二氧化钛薄膜为光催化剂，无需添加化学氧化剂，仅通过UV-A发光二极管阵列和微型加热器完成样品在线消解。UV光氧化法无法消解缩聚磷酸盐[53]。在测定水样总磷时，上述特点可能导致总磷浓度的低估。但在仅需测定水样DOP时，其他消解方法会同时消解缩聚磷酸盐而导致DOP的高估，UV光氧化法可避免此不足。

上述消解方法及其优缺点分析汇总于表1。其中，过硫酸钾-高温高压消解法虽需专属装置，但因消解能力强、效率高、操作简单、可同时处理多个样品，且拥有酸性法、中性法和碱性法以适用于不同类型水样等优点，成为目前国内外本领域的标准方法[22,37-39]。

表1 水样总磷的主要消解方法汇总Table 1 Summary of digestion methods for total phosphorus in water samples

2.2 磷酸盐的主要分析方法

目前，已有众多分析方法用于测定水样中磷酸盐，包括电化学法、化学发光(CL)法、PMB分光光度法、磷钒钼黄(VMP)分光光度法等[55]。

2.2.1电化学法诸多研究者已报道采用各种电极和相应的电化学技术检测水溶液中的磷酸根离子[56-57]。离子选择电极(ISE)是最早和最简单的磷酸盐电化学检测的传感器之一[58]，主要有液膜电极和固体膜电极。固体膜ISE的响应速度、抗干扰性能及使用寿命优于液膜ISE。最近，Pang等[59]报道了一种Co-Fe2+合金涂层的磷酸盐微型印刷电极，其线性范围较宽，检出限(LOD)为2.14 μmol/L，稳定性良好(≥16 d)，可用于地表水中磷酸盐的在线测定。相比ISE，伏安法和安培法传感器的应用受到各种困扰。近年，基于酶的安培传感器在生物医学应用中表现良好，但在环境领域中的适用性和耐用性有待验证[60]。电极微型化和纳米结构化给ISE带来了新进展，电容或阻抗法的使用也为检测nmol/L级痕量磷酸盐提供了新的可能。

2.2.2化学发光法CL法的灵敏度和线性范围等分析性能通常优于分光光度法[61]。鲁米诺CL反应体系用于测定水中磷酸盐的方法分为两类：①直接测定法，利用磷钼黄杂多酸与鲁米诺在碱性条件下反应，直接测定磷酸盐；②间接测定法，先利用酶促反应与磷酸盐形成过氧化氢，过氧化氢再与鲁米诺发生CL反应。Yaqoob等[62]基于直接测定法和流动分析技术开发了一种简单快速的流动注射CL法，样品通量达180样/h，LOD低至1 nmol/L；Liang等[63]建立了在线固相萃取-鲁米诺CL法，并成功应用于海水中痕量磷酸盐的测定。相较其他分子光谱法，CL法因无需光源和光谱解析系统而更加简单经济，且易与流动分析技术结合。

2.2.3PMB分光光度法PMB分光光度法是测定磷酸盐的最经典、应用最广泛的方法。该方法涉及的化学反应过程如式(1)、(2)所示。首先，磷酸盐与酸性钼酸盐反应，生成磷钼黄杂多酸，其随后被还原剂还原为PMB[46]。

(1)

H3PO4(MoO3)12+Reductant → [H4PMo(Ⅵ)8Mo(Ⅴ)4O40]3-(PMB)

(2)

多种不同的酸(例如高氯酸、盐酸、硫酸)和还原剂(例如抗坏血酸、氯化亚锡、硫酸肼、对苯二酚)被分别用于该反应，从而建立了产物吸收光谱有异的系列PMB方法[46]。其中，Murphy等[64]报道的方法使用最广。其以硫酸为介质，在锑盐Sb(Ⅲ)存在下以抗坏血酸将磷钼黄杂多酸还原为PMB，于最大波长880 nm处测定吸光度。该法对水样盐度的敏感性低于其他方法，且显色过程基本不受温度影响，已成为测定地表水、海水中磷酸盐的首选方法。

以氯化亚锡为还原剂的PMB法也较为广泛使用，特别是用于地表水磷酸盐分析[65]。该法相较上述抗坏血酸法，反应速率更快、PMB摩尔吸光系数更大，且能在可见光区(700 nm)测定，但受氯离子干扰较大，在海水中的灵敏度比在淡水中约低15%，精密度也有所下降[65]。

传统PMB法的LOD通常在μmol/L水平，如采用抗坏血酸和氯化亚锡为还原剂的PMB法LOD分别约为0.3、0.1 μmol/L[22]，不足以测定低营养或寡营养水体中的磷酸盐。为提高PMB法的灵敏度，研究者将其与其他富集萃取技术相结合。其中，固相萃取法因浓缩倍数大、易于与流动分析结合实现自动化而备受关注。Ma等[66]结合固相萃取和流动分析建立了海水中痕量活性磷的自动分析方法，LOD降至1 nmol/L，并成功应用于南海表层海水的走航测定。近年来，与基于注射泵的流动序批式分析技术结合，该课题组又构建了一种能测量从nmol/L到μmol/L浓度范围的磷酸盐便携式自动分析系统，成功应用于河口和沿海离散样品分析及定点在线监测[67]。

2.2.4VMP分光光度法VMP分光光度法作为推行的另一标准方法[22]，广泛应用于地表水、废水、生活污水等含磷浓度较高的水样分析。如上述式(1)描述，在酸性介质中，磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼黄杂多酸；若溶液中存在含氧酸盐(锑酸盐、锆酸盐和钒酸盐等)，可形成三元杂多酸。VMP三元杂多酸在385 nm的摩尔吸光系数最大，为3.6×103L/mol/cm[68]。形成VMP三元杂多酸的典型反应见式(3)：

H3PO4+(NH4)2MoO4+NH4VO3+H2SO4→P2O5·V2O5·22MoO3·nH2O+(NH4)2SO4+H2O

(3)

虽然VMP方法的LOD不如PMB法，但其对干扰离子的耐受性很强[69]，非常适合监测废水和受污染水体中的磷酸盐。可通过改善检测技术提高VMP法的灵敏度，Neves等[70]结合长光程流通池技术在保持高通量(60样/h)的前提下将VMP法的LOD降至0.5 μmol/L。

相较于PMB法，VMP法更适用于流动分析系统及现场测定：①VMP法简单，试剂单一且稳定，存储稳定期达1年[71]，而PMB法的试剂存储期通常仅为数周；②PMB产生时会形成细小的沉淀物，可能堵塞分析流路通道[68]，而VMP法无沉淀物生成；③PMB法的蓝色络合物易吸附在管道和流通池的内壁，影响长期测定，而VMP法无此现象。基于以上特点，VMP法在微流控领域备受欢迎[71-73]，尤其是开发长期无人值守的现场测定便携式仪器时常被采用[74]。

磷酸盐主要分析方法的优缺点及典型应用见表2。其中，经典的PMB法[64]和VMP法[22]更适用于在线、实时的测定环境，但两者分别存在试剂稳定性较差和灵敏度较低等缺点。

表2 磷酸盐的主要分析方法汇总Table 2 Summary of main analytical methods of phosphate

3 总磷的主要分析仪器

3.1 总磷离线分析流程与仪器

总磷的离线分析包括消解和测定两个步骤，通常在实验室中进行。在上述众多的总磷分析方法中，以过硫酸钾-高温高压消解、PMB分光光度法测定的分析方法最为流行，也被多国推行为实验室总磷离线测定的标准方法[22,37-39]。该法消解效率高，测定方便、简单，消解和测定相互独立，可实现离散样品的批量处理。但高温高压消解装置通常体积庞大，且具有一定操作危险，因此在现场的应用受限。

研究者从消解试剂、消解手段和消解设备等方面入手，开发了诸多改进型总磷离线分析方法。Huang等[75]以常规恒温烘箱替代高压灭菌锅，在亚沸点(90 ℃)温度下消解样品16 h，测定结果与标准方法无显著差异；Ma等[76]使用溶解度高的过硫酸钠替代过硫酸钾，并利用家用烧水壶通过沸水浴高温消解样品3 h来替代高温高压消解，实现了更简便的总磷离线分析，能较好地满足特殊场合(如船载、车载)的离线分析需求。

3.2 总磷在线分析仪器

总磷在线分析将消解和测定集为一体，可在环境水体原位或现场应用。总磷在线分析仪常采用流动分析技术，具有操作简单、易于自动化、样品通量高、重复性好、试剂和样品消耗低以及封闭分析管道污染少等优点，自引入分析化学领域后便得到迅速发展。此外，流动分析系统的资源可调度性和组件可扩展性非常强，可根据不同需求自主开发涵盖各种功能的样品前处理及分析仪器。

流动式在线消解已被认为是一种有效的总磷快速消解技术[77-78]。Gentle等[79]和Taylor等[80]采用UV-热诱导过硫酸钾在线消解法和PMB氯化亚锡还原法，分别研制了便携式总磷流动在线分析仪和总磷原位自动分析仪，并成功用于地表水和河口总磷的在线和原位观测。魏康林等[81]采用超声波辅助Fenton试剂在线消解法和PMB分光光度法，联合流动序批式分析技术，构建了常温常压条件下地表水样总磷的在线自动分析仪。Xu等[78]以流动分析技术为基础，结合UV光氧化法与VMP分光光度法，研制了将工业循环冷却水中有机膦酸在线转化为总磷并实时监测的UV消解总磷自动分析仪。所研仪器完全自动化，已成功应用于工业循环冷却水系统现场。

伴随着半导体技术、微机电系统和纳米技术的不断发展，研究者开发出“芯片式”总磷在线分析系统。Li等[82]基于光流控技术研发了集成高温消解器和光学检测的总磷在线实时监测系统，在微芯片上综合了样品消解、显色、分光光度检测等功能。Jung等[83]集成UV光氧化消解器和光度检测器，建立了微型总磷在线分析系统，在常温常压下实现水样在线消解，能在较短时间内取得与实验室高温高压法相媲美的数据。

各科学仪器公司基于流动分析技术推出了总磷在线自动监测的商品仪器(见表3)。这些仪器多采用高温高压消解法和PMB分光光度法，测定准确、可靠、稳定性好，适用于地表水、市政和工业等领域的监测。但测样时间长、体积庞大，且因是针对天然水或废水监测而研制，不宜用于海水。长期进行高温高压消解会导致管道接口老化，造成消解池泄漏；而PMB法由于所用的还原剂易被氧化，稳定性差[71]。

表3 一些商用总磷在线分析仪的参数比较Table 3 Comparison of the analytical characteristics of some commercial online TP analyzers

4 总磷分析方法及仪器发展趋势

综上所述，总磷的样品消解方法和测定方法均存在很大的局限性，使得总磷成为常规水质监测中最不易准确定量的参数之一。尽管有越来越多的商品仪器面世，为满足日益提高、日渐特殊的测定需求，研究者仍不断努力研究新方法、研制新仪器，推动小型、便携、快速、自动的水样总磷测定仪器的发展。

4.1 总磷分析方法的发展趋势

当前，总磷检测方法的自动化程度低、样品消解费时费力、所用仪器庞大昂贵，且大多数不能用于现场或实时在线监测，更难以实现长期观测。尽管传统的实验室离线分析仍是目前总磷的主要分析方法，但在线和现场分析是发展趋势。而不论是实验室离线测定还是现场在线测定，总磷分析方法均朝着仪器化、全自动化、样品通量高、精密度高、线性范围宽、试剂消耗少的方向发展。此外，发展总磷、总氮同时测定的分析方法也是环境监测领域尤其是水环境监测领域的研究热点和重点[90-91]。

4.2 总磷分析仪器的发展趋势

随着社会经济和现代科学技术的快速发展，新材料、新器件、新技术、新机理不断涌现，加工和制造工艺也得到有效改善，共同推动总磷分析仪器及相关技术的持续进步。从科学研究和仪器制造技术的角度看，总磷分析仪器总体向着“落地式-大型台式-便携式-芯片式”的方向发展，越来越模块化、在线化、小型化、自动化和智能化。现场在线总磷分析仪器是准确掌握水体总磷实时情况、及时了解突发性水体污染事件的技术支撑；流动分析技术能节约试剂、提高测定准确度和精度，也是自动化的基础；自动化和智能化可替代繁重的手工操作，减少人为因素引起的误差，提高分析结果的可靠性和实时性。