基于电感耦合等离子体质谱的肿瘤标志物检测

王超群，刘 睿，周 静，吕 弋*

(1.四川大学 分析测试中心，四川 成都 610064；2.四川大学 化学学院，四川 成都 610064)

癌症具有发病率高且生存率低的特点，是导致70岁之前死亡的首要原因。2020年全球癌症统计数据显示，全球估计有1 930万例新病例和1 000万例癌症死亡病例[1]。除遗传因素外，环境污染物、化学致癌物和不健康生活方式等多种因素也会导致癌症的发生。早期诊断和治疗可以减少医疗成本，减轻患者痛苦,是提高患者治愈率最有效的途径。因此，对恶性肿瘤的早期诊断具有重要意义。

肿瘤标志物主要包括肿瘤细胞产生的分子以及与肿瘤相关正常组织产生的代谢和免疫产物[2]。在正常人体内，肿瘤标志物通常以低水平存在，当肿瘤形成、组织转移或治疗干预后其浓度会发生变化[3]。因此，肿瘤标志物的临床分析有助于癌症的早期诊断和治疗进展监测。结直肠癌是除肺癌外死亡率最高的癌症，通过筛查检测出癌症的前体腺瘤息肉进行清除，即可预防癌症的发生[4]。数据显示，90年代中期，大多数高收入国家引入前列腺特异性抗原(PSA)检测后，前列腺癌的死亡率有所下降[1]。因此，发展检测临床样品(血液和血清等)中肿瘤标志物的高灵敏方法对疾病的诊断、预防与治疗具有重要意义。

目前，生物标志物的检测方法主要包括放射免疫分析法[5]、电泳免疫法[6]、酶联免疫吸附法[7]、荧光光谱法[8-9]、电化学法[10]和质谱法[11]等。其中，质谱法主要是基于稳定同位素标记策略和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)发展的生物分析方法[12]。ICP-MS具有分辨率高、灵敏度高、动态范围宽(9个数量级)以及可多元素同时检测的优势[13]。近二十年来，基于ICP-MS的分析方法已广泛应用于金属离子[14]、核酸[15]、肽链[16]、蛋白质[17-18]、酶分子[19-21]、其他小分子[22-23]以及单个细胞[24-25]的检测。基于金属元素螯合物、包含金属元素的聚合物以及金属纳米颗粒等金属同位素标记的质谱分析法也已被广泛用于生物标志物的检测[11]。本文总结了常见肿瘤标志物和相关癌症类型，并详细介绍了癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP) 3种最常见的肿瘤标志物及其ICP-MS检测方法。由于仅对一种肿瘤标志物检测可能会导致假阳性结果，采用多组分检测可有效降低假阳性率，提高诊断特异性。多组分检测具有样品消耗少、分析时间短、测试成本低和诊断准确性高的优势。因此，生物标志物的多组分检测受到了越来越多的关注[26]。结合激光烧蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)和流式细胞质谱仪可以实现对单个微阵列点、细胞以及癌症组织上多种蛋白的同时测量。本文也简要总结了ICP-MS在多组分生物标志物同时检测中的应用，并对多组分分析方法构建所面临的挑战进行了探讨。

1 基于ICP-MS检测的生物分析方法

质谱方法的主要构建机制包括以下步骤：首先以碱基互补配对、适体与目标物特异性结合及抗原抗体的特异性反应等生物相互作用实现对目标物的精确识别，其次，通过修饰稳定同位素标签产生ICP-MS信号。基本原理是将生物信号转化为ICP-MS信号从而实现对目标分子的定量分析。目前，该方法所涉及的稳定同位素标签包括金属元素螯合物、金属元素的聚合物以及金属纳米颗粒等[13,27]。根据生物相互作用的不同，可以将质谱分析方法分为免疫分析法和基于核酸的分析方法两类。

1.1 免疫分析方法

免疫分析方法是基于抗原抗体的特异性结合而建立的，其分析对象主要是蛋白质类的生物标志物[28]。1959年，放射性免疫分析方法首次被用于检测胰岛素[5]，该法具有较高的特异性和灵敏度，但放射性污染阻碍了其进一步的广泛应用。采用稳定同位素标签替换放射性标签，结合ICP-MS检测，不仅可以成功避免放射性污染，而且具有灵敏度高、准确性高和可多组分检测的优势。2001年，张新荣教授课题组[29]首次报道了以Eu的金属螯合物(DTTA-Eu3+)为标签的质谱免疫分析方法，实现了促甲状腺激素(TSH)的定量检测。除金属螯合物外，常用的标签还有含金属的聚合物和金属纳米颗粒等。如图1所示，一种具有多个金属螯合配体的水溶性聚合物标签[30]，在该聚合物的末端设计有马来酰亚胺基团，使其可成功地与抗体上的—SH偶联。通过改变与配体螯合的镧系元素种类，即可获得具有不同ICP-MS信号的标签。每个金属纳米颗粒和含金属聚合物标签中都具有大量的金属原子[31]，这在很大程度上提高了检测方法的灵敏度。金属纳米颗粒的悬浮液与离子溶液在ICP炬中具有相同的雾化效率[32]，表明ICP-MS具有较好的原子化效率，能够满足对各种标签的定量检测。通常在ICP-MS采集数据之前会对待测样品进行消解，以获得更准确的检测结果。

图1 金属螯合聚合物标记抗体的实验示意图[30]Fig.1 Schematic diagram of metal chelating polymer labeling antibody experiment[30]

1.2 基于核酸的分析方法

基于核酸的分析方法主要可分为两类，第一类是以适体与目标物特异性结合为基础建立的方法，主要应用于蛋白质类疾病标志物的检测；第二类是以碱基互补配对原则为基础建立的方法，主要应用于核酸类疾病标志物的检测。目前，已发展了大量基于核酸的分析方法用于肿瘤标志物的单组分[33-37]或多组分[38]检测。适体是通过指数富集(SELEX)程序为目标物筛选出的人工RNA或单链DNA。复杂的三维结构使其与目标物具有高度适配性和极高的亲和力。如图2所示，乐晓春课题组[39]分别在磁珠和金纳颗粒上修饰适配体，模拟免疫反应形成三明治结构，建立了基于适体特异性检测凝血酶的分析方法。同理，分别将磁珠和标签与目标物部分互补的两段DNA链偶联，以碱基互补配对原则形成磁珠-目标物-标签复合物，即可实现对目标链的定量检测[40]。

图2 基于适配体的ICP-MS生物分析方法示意图[39]Fig.2 Schematic diagram of aptamer-based ICP-MS bioassay[39]

2 肿瘤标志物的检测

肿瘤标志物主要包括肿瘤细胞释放的分子以及与肿瘤相关正常组织产生的代谢和免疫产物。肿瘤标志物可以提供癌症种类、肿瘤转移和预后情况等相关信息。通过非侵入式方法检测肿瘤标志物，可减少患者痛苦，减轻医疗负担，扩大筛查对象范围，为癌症的早期诊断提供有力帮助。常见的肿瘤标志物和相关的癌症类型见表1[41]。

表1 常见的肿瘤标志物和最相关的癌症类型Table 1 Common tumor markers and relevant cancer types

2.1 癌胚抗原

癌胚抗原(CEA)是胚胎发育过程中由胃肠道细胞产生的一种分子量约180 kDa的糖蛋白，在健康成年人血液中的表达水平相对较低,它是一种广谱型肿瘤标志物，浓度异常升高与大肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌有关。尽管它不能作为检测早期某种恶性肿瘤的特异性标志物，但在监测和预后方面具有重要的临床价值，特别是通过连续CEA测量来检测复发性结直肠癌[42]。

迄今为止，已经建立了许多基于ICP-MS检测CEA的免疫分析方法，这些方法大多是结合稳定同位素标签策略构建。为了控制元素标签与抗体的标记效率，标记过程中会加入过量的标签进行反应，因此必须通过分离多余的标签来降低背景信号。胡斌教授课题组[62]通过尺寸排阻色谱(SEC)法有效地分离了过量的汞和汞标记的抗体。另外，选择合适的基底材料，将抗体固定到磁珠[63]或微孔板[64]表面，待免疫反应结束后采用磁分离等手段将过量标签去除，再通过洗涤可进一步降低背景信号。考虑到分离、洗涤等步骤操作繁琐，基于单颗粒模式ICP-MS检测的均相免疫方法具有无需分离，操作简单，检测速度快的优势，故也被用于CEA分析。ICP-MS的单颗粒模式可以记录由等离子体火炬中的离子闪烁引起的瞬态信号，该瞬态信号的频率与标记在抗体上的纳米粒子数量相关。如邓必阳教授课题组[65]通过记录ZnSe量子点电离引起的瞬态信号频率成功测定了血清样品中CEA浓度。单颗粒模式ICP-MS的两种分析模式(频率和强度)相互之间具有很好的相关性，从而为准确的免疫测定提供了一种自验证机制[66]。同时记录单个金纳米颗粒的频率和强度来进行自我验证的均质免疫测定方法，可以实现更准确的定量检测。

2.2 前列腺特异性抗原与前列腺特异性膜抗原

前列腺特异性抗原(PSA)是一种分子量为33 kDa的糖蛋白酶[43]，是前列腺癌的特异性标志物。生化复发(BCR)往往早于临床症状出现，被认为是最好的前列腺癌复发预测因子，BCR的早期检测又取决于PSA分析的灵敏度。临床实践表明，监测血清中PSA对判断前列腺癌患者术后是否复发非常有效。因此，发展高灵敏的PSA检测方法具有重要意义。

近年来，纳米颗粒(NPs)被广泛应用于生物分析领域，多种类型的纳米颗粒也在质谱分析中被用作标签，包括贵金属纳米颗粒，纳米团簇(NCs)和量子点(QD)等[31]。基于纳米颗粒(例如TiO2NPs[67])标记的ICP-MS检测方法也被用于PSA检测。为进一步提高检测方法的灵敏度，Sanz-Medel课题组[68]报道了一种基于金属离子沉积的信号扩增方法。如图3所示，待PSA夹心型免疫后，Mn掺杂的ZnS量子点作为成核位点，将溶液中的金离子催化还原为单质金，检测扩增后的纳米标签即可实现信号放大。与直接标记大粒径的金属纳米颗粒相比，该方法可成功规避免疫反应时由大粒径引起的位阻效应。

图3 基于Mn掺杂的ZnS QDs标签结合金增强检测PSA的原理示意图[68]Fig.3 Schematic diagram of PSA detection based on Mn-doped ZnS QDs tag combined with gold enhancement[68]

前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种细胞表面蛋白，在侵袭性前列腺癌肿瘤中高度表达[69]，其水平升高与肿瘤体积增加和生存期缩短有关。王秋泉教授课题组[44]设计了一种近红外和电感耦合等离子体质谱双功能探针，采用两种模式分别成像和定量了PSMA及其剪接变体。

图4 基于金纳米颗粒和银纳米颗粒标签检测总AFP和AFP-L3的原理示意图[72]Fig.4 Schematic diagram of total AFP and AFP-L3 detection with gold nanoparticles and silver nanoparticles labeling[72]

2.3 甲胎蛋白

甲胎蛋白(AFP)是分子量约70 kDa的糖蛋白，在胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊产生，出生后其表达水平降低。AFP浓度的升高通常与肝细胞再生、肝癌和胚胎癌有关。肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，生存率很低。在临床上，血清中AFP的检测可结合肝超声检查对高危患者进行HCC筛查和诊断，监测部分HCC患者肿瘤进展和协助肿瘤分期等[45]。

张新荣教授课题组[70]和胡斌教授课题组[71]分别报道了基于金纳米颗粒和镧系元素掺杂的上转换纳米颗粒[71]为标签的AFP免疫分析方法。临床分析表明，AFP具有AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3三种亚型，血清中AFP-L1主要来自于良性肝病，AFP-L2主要来自孕妇，AFP-L3主要与HCC相关，当AFP-L3占总AFP的10%以上时，肝癌的发生率大于95%。因此，对AFP-L3占总AFP的比值检测具有重要意义。最近，本课题组[72]以胶体金纳米颗粒(AuNP)和胶体银纳米颗粒(AgNP)作为标记(图4)，通过不同的识别方法同时检测了总AFP和AFP-L3，检出限(LOD)分别为0.1 ng·mL-1和0.2 ng·mL-1。

3 肿瘤标志物的多组分同时检测

上述生物分析方法大多每次只检测一种肿瘤标志物，但大多数肿瘤标志物不止对应一种癌症(如CEA与多种癌症相关)，且大多数癌症也不止对应一种肿瘤标志物，仅检测一种肿瘤标志物可能会导致假阳性结果。采用多组分检测可有效降低假阳性率，提高诊断特异性。与单组分检测相比，多组分检测具有样品消耗少、分析时间短、测试成本低和诊断准确性高的优势。因此，生物标志物的多组分检测受到了越来越多的关注[26]。

多组分分析方法的设计需考虑两个要素：①设计可区分的标记探针；②提高方法的灵敏度，补偿因待测物增加而降低的信噪比。目前，基于不同镧系元素或纳米颗粒为标记的方法已被大量用于同时检测多组分miRNA类[73-75]和蛋白质类[47]肿瘤标志物。如Lobinski课题组[76]利用高分辨率尺寸排阻色谱法结合5种不同镧系元素实现了对5个癌症生物标志物(AFP、hCG、CEA、CA125和CA19-9)的检测。本课题组[77]以3种纳米颗粒(AuNP、AgNP和PtNP)为标记，采用单颗粒ICP-MS的同时检测了3种胰腺癌标记物(CA125、CEA和CA199)。在此基础上，结合激光烧蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)检测手段可实现在单个微阵列点[78]、蛋白质印迹膜[79-80]、细胞[81]以及癌症组织上[61]的蛋白质多组分分析；结合流式细胞质谱仪可实现对单个细胞上多种蛋白的同时检测[25,82]。结合信号放大手段可进一步提高方法灵敏度，如RCA[18,83]、PCR、DNA核酶催化[84]和双链特异性核酸酶扩增[38]等。张新荣教授课题组[85]将叠氮修饰的镧系金属螯合物与具有大量炔烃DNA支架(PCR技术合成)发生点击反应实现了信号放大，与单元素标签相比，该方法检出限大约降低了2个数量级。

4 结论与展望

ICP-MS具有分辨率高、灵敏度高、动态范围宽以及可多元素同时检测的优势。基于金属元素螯合物、包含金属元素的聚合物以及金属纳米颗粒等标记策略，结合ICP-MS的生物分析方法已广泛应用于肿瘤标记物的检测。将其用于多组分标志物检测，可提高疾病诊断的准确率，同时节约测量成本和减轻患者痛苦。但这些方法仍然存在一定的局限性，例如：基于镧系元素螯合物标记的方法灵敏度低；基于金属纳米颗粒标记的方法非特异性吸附高，往往需要复杂的封闭程序来减少背景信号；多组分检测方法还存在交叉反应及待测物数量增加导致灵敏度降低的缺点。尽管如此，基于元素标记的ICP-MS检测生物分析方法仍然具有非常可观的发展前景，在未来我们可以：①发展基于ICP-MS检测的新型创新策略；②将ICP-MS与其他技术(例如大数据分析)相结合，获得更准确的检测结果；③发展灵敏度更高和更可靠的定量分析方法，将实验室研究成果转化为临床应用技术。