益艾康胶囊联合HAART对HIV感染者外周血和Th1/Th2细胞因子的影响*

李 杰，岳静宇，邓博文，桑 锋，刘 真，李 强，郭会军

(河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心，河南 郑州 450000)

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)自从20世纪80年代开始大流行以来，已夺走了超过3 500万人的生命[1]。截至2019年10月底，我国现存活HIV感染者约95.8万例，死亡15.4万例，有效预防与治疗艾滋病、控制疾病传播成为亟待解决的问题[2-3]。高效抗逆转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy，HAART)可有效抑制病毒核酸，但药物存在交叉耐药性、不良反应大等问题。中药具有多系统、多环节、多靶点调控的特点，在预防和治疗复杂、慢性疾病方面有独特优势。益艾康胶囊是国家中医药治疗艾滋病试点项目制剂，由人参、黄芪、炒白术、茯苓、当归、川芎、白芍、黄芩等中药组成，具有益气健脾、化湿解毒之功效。2004年至今，益艾康胶囊已累计救治4 586例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染者，取得了较好的临床疗效。研究[4-5]表明：多种免疫细胞及其分泌的细胞因子参与了艾滋病发病机制和疾病进展，并和血浆 HIV 病毒载量及外周血 CD3+、CD4+、CD8+T细胞数量有关。益艾康胶囊作为一种加强抗 HIV 病毒效果辅助治疗艾滋病的药物[6-7]，可能通过影响这些细胞因子从而在AIDS治疗过程中起重要作用。本研究对河南部分地区HIV感染者给予益艾康胶囊联合HAART后9种Th1/Th2细胞因子、T细胞亚群和病毒载量的变化及相关性进行探讨，现报道如下。

1 研究对象

以河南中医药大学第一附属医院艾滋病临床研究中心HIV感染者血液样品库为依托，筛选已使用HAART预加服中药益艾康胶囊治疗患者30例，年龄18～60岁，其中男22例，女8例。符合如下条件：①HIV抗体证实阳性的感染者；②18<年龄<60岁，能配合研究者；③签署知情同意书，自愿受试者；④排除合并严重心、肝、脑、肾等原发性疾病者；⑤严重精神疾病者；⑥妊娠或哺乳期妇女及对中药制剂过敏者。

2 药 物

益艾康胶囊(由河南省中医药研究院附属医院制剂室生产，产品批号20160624，0.5 g/粒)，5粒/次，3次/d，温开水送服。参照《中医药治疗艾滋病临床技术方案(试行)》[8]及《河南省中医药治疗艾滋病常见病症辨证治疗要点》[9]，根据患者症状、体征、脉象、舌象等信息进行中医辨证论治。

3 试剂与仪器

人Th1/Th2细胞因子检测试剂盒(Pro Human Cytokine Th1/Th2 Panel，9-plex)，批号 5028196，规格 96 T，伯乐(Bio-Rad)公司生产；人类免疫缺陷病毒(Ⅰ型)核酸检测试剂盒(COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test，v2.0)，批号 E33143，规格 48 T，罗氏(Roche)公司生产；绝对计数管(TruCOUNT tube)，批号 9263343，规格 50 T，BD公司生产；荧光单克隆抗体试剂盒(CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP/CD8-APC)，批号 61872，规格 50 T，美国BD公司生产；流式细胞溶血素(FACS 溶血素)，批号 6204937，规格100 mL，美国BD公司生产。

高通量细胞因子检测系统，型号 Bio-Plex 200，Bio-Rad公司生产；全自动病毒载量仪，型号 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan，Roche公司生产；流式细胞仪，型号BD FACSCalibur，美国BD公司生产。

4 方 法

4.1 分组与研究方法

分别于治疗前、治疗6个月、治疗1年时，采用抗凝管(EDTAK2)采集益艾康胶囊联合HAART患者肘静脉血，并分离血浆，检测细胞因子和T细胞亚群。病毒载量仅检测治疗前和治疗1年时。

4.2 Th1/Th2细胞因子检测

血浆样品用样品稀释液稀释4倍，细胞因子标准品用标准品稀释液稀释系列浓度(8个)，微珠、检测抗体和PE标记链霉亲和素(Streptavidin-PE)分别用分析缓冲液、抗体稀释液和分析稀释液稀释成1×使用液，实验操作按照试剂说明书进行。检测的细胞因子包括：白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。高通量细胞因子检测系统开机后，分别使用2种校准试剂(Calibration和Validation)校正仪器，将处理后的96孔板上机检测，流式荧光法扫描检测结果，检测结果单位为ng/L。

4.3 HIV核糖核酸检测

取1 mL血浆加入样本管(S-tube)中，将样本管置于样本架上加载至仪器，加载试剂与耗材样本处理单元(SPU)、K-枪头(K-tip)和K-管(K-tube)，采用全自动病毒载量仪检测血浆病毒载量。检测方法为Real-time PCR定量检测血浆中HIV核酸量，扩增的靶区域为 HIV 结构基因gag 区。试剂为内标法，设有阴性、弱阳性和强阳性质控品各1个。检测范围20～1×107copies/mL。

4.4 T淋巴细胞亚群检测

TruCOUNT tube中加入20 μL CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP/CD8-APC混合抗体，再加入50 μL全血样品，振荡混匀，室温18～25 ℃,避光孵育20 min，然后加入1×FACS溶血素450 μL，混匀室温避光孵育20 min后用流式细胞仪上机检测，采用多色分析软件以CD45+设门，记录CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞数。

4.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件分析数据，采用配对样本t检验对9种细胞因子、CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞3次结果均数进行比较；采用多元回归模型分析9种细胞因子与病毒载量、T淋巴细胞亚群的相关性。检验水准α=0.05。

5 结 果

5.1 随着治疗时间增加,9种Th1/Th2细胞因子变化对比

与同组治疗前对比，两组IL-2、IL-4、IL-5等9种细胞因子在益艾康联合HAART 6个月、1年时均升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 随着治疗时间增加HIV感染者外周血中9种Th1/Th2细胞因子变化对比

5.2 随着治疗时间增加,T淋巴细胞亚群对比

CD3+T和CD8+T细胞计数在治疗6个月和治疗1年时与治疗前对比，差异无统计学意义(P>0.05)。CD4+T细胞计数治疗6个月与治疗前对比，差异无统计学意义(P>0.05)；但治疗1年时与治疗前对比，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 随着治疗时间增加HIV感染者外周血中T淋巴细胞亚群对比

5.3 多元回归模型分析治疗1年前后病毒载量与9种细胞因子2次结果均数之间的相关性对比

回归分析结果中ANVOA(方差分析)显示：F=2.11，P=0.048，回归模型有相关性。相关性分析结果显示：IL-2(r=0.25，P=0.03)、IL-10(r=0.28，P=0.01)、IL-13(r=0.27，P=0.02)和TNF-α(r=0.22，P=0.04)分别与病毒载量有低度正相关性关系(P<0.05)。见表3。

表3 多元回归模型分析益艾康胶囊治疗HIV感染者1年前后病毒载量与9种细胞因子2次结果均数之间的相关性对比 n=30

5.4 9种细胞因子与T淋巴细胞亚群的相关性

相关与回归分析结果均显示：随着CD4+T细胞升高，TNF-α有增加趋势，其余细胞因子有下降趋势；CD3+T和CD8+T细胞与9种细胞因子变化趋势一致，但无相关性(P>0.05)。

6 讨 论

研究发现：多种免疫细胞及其释放的细胞因子参与了HIV/AIDS的发病机制，并和血浆HIV病毒载量相关[4]。CD4+T细胞起初是根据其细胞因子分泌模式来定义的。Th1应答产生IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α等，驱动细胞免疫反应控制细胞内病原体；Th2应答产生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子，促进体液反应控制细胞外病原体。随着研究的不断深入，发现这些细胞的某些功能和产生的细胞因子存在重叠[10-11]。在早期的HIV感染中，上述细胞因子风暴主要由促炎性细胞因子反应组成，与Th1反应一致。这些细胞因子中的某些具有抗病毒活性，如IFN-γ可以增强先天和适应性细胞免疫应答，但强烈的早期细胞因子反应可能会促进病毒复制和免疫病理[10]。

《医权初编》云：“气聚则生，气壮则康，气衰则弱，气散则亡。”“气虚”是艾滋病的基本病机，气对机体的生理、病理，以及病情变化起着重要的作用[12]。《黄帝内经》云：“正气存内，邪不可干。”“邪之所凑，其气必虚。”在这里，“气”指机体的免疫功能。艾滋病病因中外因为感染温邪疫毒，内因为正气受损，精气不足，气血亏虚。结合辨证论治给予合适的中药治疗可以将正气调节到正常的水平[13]。本研究观察了患者在中药复方益艾康胶囊联合HAART后1年内3次Th1/Th2细胞因子的检测结果，发现中西医联合治疗半年和1年后，细胞因子水平均较治疗前有所升高，9种细胞因子均在治疗半年后明显升高，治疗1年后逐渐降低，体现了中药治疗的整体观念，表明中药对免疫因子的调节是双向的。外邪入侵激活机体免疫细胞，改变细胞因子水平；但艾滋病的主要特征是持续低水平的异常免疫激活[14]，强烈的细胞因子风暴也会对机体造成损伤。因此，不同程度地矫正这些细胞水平可影响免疫应答过程，进而影响AIDS疾病进展。在治疗1年后，患者的CD4+T细胞计数明显升高，与治疗前对比差异有统计学意义(P<0.05)，进一步表明中西医结合治疗能够提高CD4+T数量，有利于免疫功能重建。对这些细胞因子与病毒载量进行回归分析，发现IL-2、IL-10、IL-13和TNF-α与病毒载量有低度正相关性关系，表明适度降低这些细胞因子水平，可能有助于抑制病毒核酸，其具体机制需进一步深入研究。