生皮散对大鼠感染性创面微循环的保护作用

阳梅 廖诗平 郑焱江 植茂辉 何张裕

(1.四川大学华西医院血液内科，四川 成都 610041；2.四川大学华西护理学院，四川 成都 610041；3.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041 )

不同原因造成的皮肤损伤是外科领域常见的临床挑战，如何加快创面组织愈合，获得理想的疗效一直是临床工作追求的目标。研究表明72.5%的慢性创面由感染导致，是阻碍创面正常修复的重要因素之一[1-3]。完全上皮化是创面临床愈合的标志，而感染性创面由于处于病理性炎症状态，炎性细胞在局部过度积累，且炎性介质调节机制失调，加重组织损伤程度，导致创面上皮化进程缓慢[4-7]。在创面治疗方面，西医主要以外用抗生素或激素治疗为主，但近年来细菌的耐药情况日趋严重，并且病人对药物敏感，导致疗效不佳。中医学对于创伤的修复具有丰富的经验和独特的治疗方案，在长期的历史发展中形成了独具特色的理论体系。中医普遍认为创面的形成是由于全身营养消耗明显，气血亏虚，不能营养肌肤，摩擦破伤感染，引起坏死溃烂[8-10]。因此，中医创立了祛瘀生肌、偎脓长肉等重要理论与治法。在中医临床实践中，药物疗效和安全性往往相悖，如朱红膏治疗慢性皮肤溃疡，但因含汞元素，临床安全期仅有6周。因此需要开发新的安全有效的中药制剂治疗感染性创面[11]。生皮散是改良的新型中成药制剂，以儿茶、冰片、没药、乳香、三七等十味中药配伍组成，配方中儿茶、没药、乳香、三七、血竭等均能祛腐生肌、活血；而冰片、枯矾、黄柏、滑石等能清热解毒。有研究报道，生皮散对大鼠压疮具有较好的治疗效果，可以显著抑制压疮局部的炎症反应，减少炎症因子的释放，缩短创面愈合时间[12]。为探讨生皮散对感染性创面的治疗效果和可能的作用机制，本研究通过构建大鼠感染性创面模型，观察外敷生皮散后大鼠感染性创面的愈合情况，同时采用激光多普勒血流仪检测创面微循环的变化情况，探讨生皮散修复创面的作用机制，为其临床用药提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 受试药品 生皮散，组成：儿茶12 g、煅牡蛎25 g、冰片1.2 g、没药7.5 g、乳香7.5 g、枯矾6 g、三七6 g、黄柏7 g、血竭 50 g、滑石 15 g。制作方法：以上各药共研细末，过100目筛，待用。以上中药饮片均购置于四川省中药饮片有限责任公司,批号：150523。用法用量：外敷，一次4 g生皮散原生药材，一日2次；即临床成人(均以60 kg体重计)日用剂量拟定为0.13 g(原生药材)/kg/d。用时溶于蒸馏水成膏状备用。七厘散：散剂，规格：3 g/瓶。用法用量：口服，一次1～1.5g，一日1～3次；外用，调敷患处。北京同仁堂出品，批号：20150716，实验时用灭菌水制成膏状备用。

1.2 试剂与仪器 水合氯醛：分析纯，AR级，成都市科龙化工试剂厂，批号：20150619。实验时用纯净水配制成浓度10%。激光多普勒血流仪(PeriFlux 5000系统)，瑞典帕瑞医学。AX-70显微镜成像系统，OLYMPUS。

1.3 实验动物 SD大鼠，健康一级，体重(250±20)g，雌雄各半，四川大学试验动物中心提供，合格证号：SCXK(川)2009-09，清洁级。于恒温清洁环境中进行适应性饲养，饮水进食不限，持续1周。

1.4 菌株 金黄色葡萄球菌，由四川大学华西基础医学与法医学院微生物教研室提供。

1.5 方法

1.5.1 感染性创面模型制备 参照杨嘉骏等[13]制备大鼠感染性创面模型的方法。用剃毛器将大鼠背部区域毛发剃除，面积3 cm×3 cm。1 d后将以10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射对大鼠进行麻醉，并在脱毛区域用1.5 cm×1.5 cm的塑料框架蘸苦味酸标记造模面积，在无菌条件下切除标记处全层皮肤，深至筋膜，充分止血后在创面喷洒金黄色葡萄球菌的PBS液0.2 mL(1×109CFU/mL)。创面覆盖透明薄膜敷贴并用无菌医用纱布包裹固定，待清醒后单笼饲养。48 h后创面出现不同程度感染征象，如创面附有脓性分泌物，创缘皮色发红，表示造模成功。

1.5.2 实验分组及给药 将符合条件的60只SD大鼠，随机选取10只作为空白组(正常大鼠)，其余大鼠制备感染性创面模型。48 h后，将接种细菌的大鼠随机分为模型组、阳性对照药七厘散组(0.45 g/kg)、生皮散高、中、低剂量组(1.8 g/kg、0.9 g/kg、0.45 g/kg)。给药组和阳性对照组按分组给药，连续15 d。空白组用蒸馏水冲洗后不作处理。

1.5.3 观察指标

1.5.3.1 创面愈合情况 分别在造模后第3、5、7、10、15 d用透明硫酸铜板纸贴在创面表面，用笔在纸上描记创面面积。

1.5.3.2 形态学检测 给药后15 d取各组大鼠创面与正常皮肤交界组织，进行固定、石蜡包埋、切面，常规HE染色。根据盲法原则，采用OLYMPUS公司AX-70显微镜成像系统进行观察分析及照相。

1.5.3.3 创面微循环血流量的测定 使用激光多普勒血流仪分别测量大鼠创面微循环血流量，血流量指标包括：血流灌注量(PU)、血细胞聚集程度(CMBC)以及运动血细胞速率(Velocity)。大鼠麻醉后，在室温(25℃)下适应环境30 min。激光多普勒血流仪预热30 min，并校准。选用公司配置的接触型探头，分别于给药前和给药后15 d测量创面微循环的相关指标。并计算出血流量的变化率。变化率=(造模前血流量-给药15 d后血流量)/给药前血流量×100%；血流灌注量变化率(PU)=(造模前PU-给药15d后PU)/造模前CMBC；血细胞聚集程度(CMBC)=(造模前CMBC-给药15d后CMBC)/造模前CMBC；运动血细胞的速率(Velocity)=(造模前Velocity-给药15d后Velocity)/造模前Velocity。

2 结果

2.1 生皮散对大鼠体表感染创面愈合的作用 在大鼠创面滴加金黄葡萄球菌48 h后，出现不同程度感染，创面附有脓性分泌物，渗液较多，创缘皮色发红。每日新鲜配置不同浓度的生皮散等量涂于创面，于第3、5、7、10、15 d测量创面面积。与模型组相比，生皮散高剂量组大鼠的创面面积从第5d开始显著减少(P<0.05)，一直持续到第15 d；七厘散组和生皮散中、低剂量组大鼠的创面面积从7 d开始显著减少(P<0.05)，其中，中剂量组持续至15 d；低剂量组持续到第10 d。与七厘散组相比，生皮散高、中剂量组大鼠的创面面积无显著性差别。说明生皮散有明显促进感染性创面愈合的作用，其中，高、中剂量更好,见图1、表1。

图1 治疗前后大鼠感染性创面改变Figure 1 Change of infectious wound before and after treatment注：①,②.模型组；③,④.七厘散组；⑤,⑥.生皮散低剂量组；⑦,⑧.生皮散中剂量组：⑨,⑩.生皮散高剂量组

表1 生皮散对大鼠感染性创面大鼠创面面积的影响Table 1 Effect of SPP on area of infectious wound in rat

2.2 生皮散对大鼠感染性创面的病理学改变 空白组上皮组织大部分生成，表皮细胞分化良好，接近正常上皮，其下为平行排列的胶原纤维及小血管；模型组新生表皮较空白组表皮肥厚，其下可见大量增生的胶原纤维及炎性细胞，部分出现坏死后钙化；生皮散组镜下显示，中、低剂量组新生表皮均较空白组表皮肥厚，其下为增生的胶原纤维及少量炎细胞，高剂量组新生表皮和空白组接近，仅部分出现炎症细胞，见图2。

图2 生皮散对大鼠感染性创面的病理学改变(200×)Figure 2 Pathological changes of SPP on infectious wound in rats 注：A.假手术组；B.模型组；C.七厘散组；D.生皮散低剂量组；E.生皮散中剂量组；F.生皮散高剂量组

2.3 生皮散对大鼠感染性创面微循环的保护作用 与空白组相比，模型组PU、CMBC以及Velocity变化率均明显增高(P<0.01)，说明造模后，大鼠的创面组织微循环发生严重障碍。与模型组相比，七厘散组和生皮散低剂量组的CMBC和Velocity变化率，生皮散中剂量组的PU和CMBC变化率以及生皮散高剂量组的PU、CMBC、Velocity变化率均显著降低(P<0.05)。与七厘散组相比，生皮散中剂量的PU，高剂量的PU和Velocity均显著降低(P<0.05)。说明生皮散能改善大鼠感染创面的微循环，生皮散高剂量组效果更好,见表2、图3。

表2 生皮散对大鼠感染性创面微循环变化率的影响Table 2 Effect of SPP on change rate of infectious wound microcirculation in rat

图3 生皮散对大鼠感染性创面微循环变化率的影响Figure 3 Effect of SPP on change rate of infectious wound microcirculation in rat

3 讨论

感染性创面是临床多种疾病常见的并发症，如下肢静脉溃疡和糖尿病足部溃疡，坏疽性脓皮病以及外伤或放射性损伤合并感染等导致的创面等[14]。不同原因导致的感染性创面有不同的病理生理过程，但共同的结局是创面愈合缓慢或愈合后复发，显著降低了患者的生活质量，是临床治疗的难点[15-16]。

现代病理学认为创伤愈合是再生肉芽组织的充填及上皮组织覆盖而愈的过程[17]。研究发现生肌类中药具有促进疮疡愈合的作用，该类中药除了加强创面免疫细胞活性、促进细胞生长因子之外，还能够显著改善创面微循环，因此在创面愈合中疗效显著[18]。

微循环是血液循环中非常重要的组成部分，包括微动脉、毛细血管、微静脉。血液微循环和淋巴微循环一起组成微循环功能单元，承担血液与组织之间氧、营养必需物质和代谢产物的交换及能量、信息传输，承担血流流通、分配、组织灌注和一系列反馈调节、内环境稳定机制[19-20]。因此，微循环不仅是整体循环系统的末梢部分，也是许多器官中独立的功能单位，在保持人体正常生理功能，各种疾病发生、发展和药物作用机制中占突出地位[21]。由于各种原因导致行动不便的病人，因长期久卧致使皮肤表面无法及时更新血流供给，加之医院易形成交叉感染，导致感染创面形成。有研究证实随着创伤形成时间的延长，创面细小血管内血流速度逐渐减慢，甚至会发生瘀滞栓塞[22]。创面微循环障碍，不但导致局部营养物质供应减少和代谢产物积聚，还会造成创面免疫细胞数量减少、功能下降，抗感染能力减弱[23]。所以，改善微循环对于创面治疗是非常重要的环节。

生皮散的组成成分儿茶、没药、乳香、三七、血竭等均能祛腐生肌和活血，因此生皮散具有改善血液循环的作用。本研究发现生皮散的外敷使得创面局部的血液循环得以改善，创面血管扩张，新生毛细血管的数量增加，血流量增加，免疫细胞增加，促进淤血合增生的软化组织被吸收，也为创伤组织提供愈合所需的条件和营养。生皮散中药制剂其组分可以有效改善创面局部微循环状况，调动皮肤修复功能，促进创面愈合。然而由于该中药方剂中药味成分较多，还需要深入研究探索各组分的作用特点，阐明复方制剂的作用机制，为临床用药奠定实验基础。

4 结论

本实验采用切除全层皮肤，并在创面滴加金黄葡萄球菌的方法制备大鼠感染性创伤模型，造模48h后创面出现不同程度感染特征：创面附有脓性分泌物，渗液较多，创面边缘皮色发红。给予生皮散15d后，创伤面积显著缩小，炎症细胞减少，出现大量新生肉芽组织；创面组织微循环灌注量、血细胞的聚集程度以及运动学细胞的速率得到明显改善。表明生皮散对感染性创面有良好的治疗作用，具有开发应用价值。