右美托咪定通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对肝叶切除术后神经认知功能障碍大鼠海马神经元自噬的影响*

2021-06-30程亮亮田毅谭义文王丹

西部医学 2021年6期

程亮亮田毅谭义文王丹

(中南大学湘雅医学院附属海口医院麻醉科,海南海口 570208)

术后神经认知功能障碍(Post-operative neurocognitive dysfunction，PNCD)是老年麻醉手术后常见的中枢神经系统并发症，具有记忆受损、认知功能异常等表现，影响疾病恢复进程，甚至会发展为老年痴呆，严重影响患者的生活质量[1]。目前，临床尚无有效防治PNCD的手段，部分药物通过减轻全身炎症或营养神经治疗效，但果仍不理想[2-3]。临床研究表明，临床常用吸入麻醉药物，如七氟醚、氟烷等，具有诱导迅速、无明显蓄积、苏醒快等优点，但高浓度药物仍会对中枢神经功能造成损伤，尤其是老龄人群广泛存在脑组织功能退化，麻醉术后PNCD发生风险较高[4-5]。动物实验研究发现[6-7]，七氟醚吸入麻醉可能通过激活海马神经元自噬引起海马神经元损伤，具有一定神经毒性作用。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)属于高选择性α2肾上腺素能受体(α2 adrenergic receptor，α2-AR)激动剂，具有镇静、镇痛作用，常于老年患者麻醉诱导前用药，以稳定诱导过程中血流动力学，辅助全身麻醉[8-9]。近年来，有报道认为DEX可预防老年非心脏手术患者术后PNCD发生风险，但具体影响机制尚不明确[10]。鉴于此，本研究在七氟醚麻醉下采用肝叶部分切除术建立PNCD大鼠模型，模拟腹腔术后神经功能损伤，观察不同剂量DEX通过自噬信号通路磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)对老年PNCD大鼠神经功能的影响，为DEX临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂右美托咪定(江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20090248，规格2 mL:200 μg，批号：10081435)，七氟醚(湖北广奥生物科技有限公司，批号：6120104)，逆转录试剂盒(日本Takara公司，批号：D31145791)，兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)单抗(批号：ab11362)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)单抗(批号：ab12054)、磷酸化Akt(phosphorylation of Akt，p-Akt)多抗(批号：ab37159)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)单抗(批号：ab60218)、自噬标记蛋白Beclin-1(批号：ab55140)、微管相关蛋白轻链3(light chain 3，LC3，批号：ab12194)(一抗，美国Abcam公司)，山羊抗兔PI3K(批号：ab13446)、Akt(批号：ab20137)、p-Akt(批号：)、mTOR(批号：ab32194)、Beclin-1(批号：ab01510)、LC3(批号：ab00120)(二抗，美国Abcam公司)。

1.2 主要仪器 CM-120型透射电镜(荷兰PHILIPS公司)，Morris水迷宫及其配套图像采集分析系统(北京微信斯达科技发展有限责任公司)，3550UV酶标仪、7000实时荧光定量PCR仪、电泳仪、CheniDoc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-rad公司)。

1.3 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只，18月龄，体质量(600±100)g，购自南京大学模式动物研究所，许可证号：SCXK(苏)2018-0001，饲养条件：室温(24±1)℃，60%湿度，12 h/12 h昼夜节律照明，2只/笼饲养，自由饮水和进食。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及干预采用随机数表法将50只SD大鼠分为5组：对照组、模型组、DEX低、中、高剂量组5组。模型组吸入3%七氟醚麻醉；DEX低、中、高剂量组分别预先腹腔注射25、50、100 μg/kg右美托咪定(按照人与动物体表面积换算法换算临床等效剂量为6.3 μg/kg，DEX低、中、高剂量分别约为4倍、8倍、16倍临床等效剂量)，30 min后3组均吸入3%七氟醚麻醉。各组大鼠麻醉后，参照文献[11]均进行部分肝叶切除术，建立PNCD大鼠模型，Morris水迷宫试验检测结果与对照组相比差异显著，即为建模成功。对照组大鼠腹腔注射生理盐水2 mL/kg，持续麻醉2 h(手术均结束)。

1.4.2 修正神经功能缺损程度(neurological severity score，NSS)评估术后1、3、7 d采用NSS评分量表[12]对各组大鼠神经功能缺损程度进行评估，包括提尾、行走、感觉、平衡、反射5个试验内容，每个试验评分3、3、2、6、4分，总分18分，分数越高提示神经功能缺损越严重。

1.4.3 认知功能评估采用Morris水迷宫试验[13]对各组大鼠认知功能进行评估：水迷宫直径1.5 m、水深0.75 m、控制水温(25±1)℃，将水池分为4个象限，安全岛置于第I象限，水下1 cm，宫体正上方摄像头可记录运动轨迹，固定4各入水点和固定实验时间。术后第7 d开始进行适应性训练1次，实验分两部分：①术后第8～11 d定位巡航试验，随机选取某1象限入水点，大鼠面对宫壁轻放入池，开始计时，记录60 s内找到并登陆安全岛的时间，即逃避潜伏期；若60 s内未找到安全岛，由实验者引导大鼠至安全岛，并停留30 s，逃避潜伏期记录为60 s。每个象限入水1次/d，共入水4次/d，每次间隔2 h。②术后第12 d进行空间探索试验，撤去安全岛，随机选择入水点，记录60 s内的游泳轨迹，统计目标象限游泳距离占比，即大鼠在目标象限(第I象限)内的游泳距离/总游泳距离×100%。

1.4.4 海马神经元超微结构观察水迷宫试验结束后，立即处死各组大鼠，冰冻手术台迅速取出脑组织，取左侧海马组织，修整为边长为1 cm的组织块，放置于4%戊二醛中固定4 h，然后放置1%锇酸固定30 min，脱水后树脂包埋，制作厚度为50 nm切片，进一步醋酸双氧铀、枸橼酸铅双染色，透射电镜下观察、拍照，计数自噬小体数目。

1.4.5 海马PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA检测水迷宫试验结束后，处死大鼠后取部分右侧海马组织，剪碎后提取组织中取总核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)含量，逆转录法获得互补链脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，经鉴定后进行实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反应体系：Taq酶 11.5 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL；反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复35个循环。以β-actin为管家基因，2-△△CT为目的基因的相对表达强度，重复3次取Ct平均值。引物序列，见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.6 海马PI3K、pAkt、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3-II、LC3-I蛋白检测水迷宫试验结束后，处死大鼠后取部分右侧海马组织，加入液氮研磨，加入细胞裂解液，沸水浴8～10 min，12000 r/min离心15 min，取上清液，蛋白定量后，取40 μg样品于上样缓冲液混匀，沸水浴3 min，再次离心收集上清液，然后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，电转仪转膜60 min，加入封闭液摇床2 h(室温)，洗涤后加入一抗(1∶1000)，摇床孵育过夜(4℃)，洗涤后二抗(1∶8000)，孵育60 min(常温)，暗室中曝光，并于凝胶成像系统中扫描，进行灰度值分析，以目的蛋白与内参β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠神经功能缺损程度对比术后50只大鼠均存活。DEX各剂量组NSS评分术后3 d、7 d均低于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍高于对照组(P<0.05)；DEX各剂量组术后NSS评分均随时间的延长而降低(P<0.05)，模型组术后7 d较术后3 d稍有降低，但较术后1 d仍较高(P<0.05)，而对照组无明显变化，见表2。

表2 NSS评分对比Table 2 Comparison of NSS scores

2.2 逃避潜伏期、目标象限游泳距离占比对比 DEX各剂量组术后9～11 d逃避潜伏期均短于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍长于较对照组(P<0.05)；对照组、3剂量组逃避潜伏期随时间而缩短(P<0.05)，而模型组无明显变化。DEX各剂量组目标象限游泳距离占比均高于模型组，其中DEX低剂量组<中剂量组<高剂量组，但仍低于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 逃避潜伏期、目标象限游泳距离占比对比Table 3 Comparison of escape latency and target quadrant swimming distance

2.3 海马神经元超微结构观察透射电镜观察结果显示，对照组未观察到自噬小体，模型组自噬小体广泛存在(8.20±0.94)个/视野，形态多样化，可见双层膜包裹的颗粒状细胞质或退化细胞器。DEX各剂量组自噬小体数量减少，DEX低、中、高剂量组分别为(5.58±0.50)个/视野、(4.22±0.37)个/视野、(2.07±0.24)个/视野；DEX各剂量组自噬小体数目均少于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍多于对照组(P<0.05)，见图1。

图1 透射电镜下海马神经元超微结构图片(×12 K)Figure 1 Ultrastructural picture of hippocampal neurons under transmission electron microscopy注：Ly.溶酶体；M.线粒体；N.细胞核；红色箭头为自噬小体

2.4 海马PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA表达对比 DEX各剂量组PI3K、mTOR mRNA相对表达量均高于模型组，其中DEX低剂量组<中剂量组<高剂量组，但仍低于对照组(P<0.05)；DEX各剂量组Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量均低于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍高于对照组(P<0.05)，Akt mRNA相对表达量组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量对比Figure 2 Comparison of relative expressions of PI3K,Akt,mTOR,Beclin-1 and LC3 mRNA

2.5 海马PI3K、mTOR、Beclin-1蛋白表达及pAkt/Akt、LC3-II/LC3-I对比 DEX各剂量组PI3K、mTOR蛋白相对表达量、pAkt/Akt均高于模型组，其中DEX低剂量组<中剂量组<高剂量组，但仍低于对照组(P<0.05)；DEX各剂量组Beclin-1蛋白相对表达量、LC3-II/LC3-I均低于模型组，其中DEX低剂量组>中剂量组>高剂量组，但仍高于对照组(P<0.05)，见图3。

图3 海马PI3K、Akt、pAkt、mTOR、Beclin-1、LC3-I、LC3-II蛋白表达(n=4，Figure 3 Expressions of PI3K,Akt,pAkt,mTOR,Beclin-1,LC3-I and LC3-II in hippocampus 注：与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与DEX低剂量组比，③P<0.05；DEX中剂量组比，④P<0.05注：与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05；与DEX低剂量组比，③P<0.05；DEX中剂量组比，④P<0.05

3 讨论

中枢神经功能损害属于麻醉手术后常见并发症，临床多表现为记忆、学习、认知功能异常等，可能持续数月甚至更长时间[14-15]。动物实验表明[16-17]，麻醉及手术应激可引起PNCD，其多能自行恢复，但对神经系统仍会造成一定损伤。PNCD发生机制复杂，涉及多种蛋白质表达及信号通路调控作用，最终可引起海马神经元细胞死亡。DEX属于美托嘧啶的异构体，其作用机制为通过激动脑脊髓中α2-AR而发挥镇静、止痛和抗交感作用，且已有研究证实DEX对多种脑损伤具有神经保护作用[18-20]。

水迷宫定位巡航和空间探索实验可评估大鼠的学习、记忆功能。寻找休息场所是动物本能，该过程可反应出大鼠对复杂信息的采集、整合和学习能力，寻找目标象限完成度与海马区结构和功能、中枢神经功能损害等关系密切[21]。本研究采用麻醉下行部分肝叶切除术法制备PNCD大鼠模型，模拟临床剖腹手术对机体神经功能的影响，术后采用水迷宫实验检测发现，逃避潜伏期长于对照组，目标象限游泳距离占比短于对照组，提示麻醉下行部分肝叶切除术法制备PNCD成功。DEX可有效抑制交感神经兴奋，激活突触前膜α2-AR(α1∶α2=1∶1600)[22]，继而负反馈抑制突触后膜兴奋，降低交感神经兴奋性。魏晓等[23]研究发现，麻醉前应用DEX有助于维持围术期血流动力学稳定，降低PNCD发生率，与本研究结果相似。本研究对PNCD大鼠术前应用不同剂量DEX干预，术后NSS评分低于模型组，逃避潜伏期均短于模型组，但仍长于对照组，目标象限游泳距离占比均高于模型组，但仍低于对照组，且均具有剂量依赖性，由此可知，DEX对减轻老年大鼠PNCD神经功能损伤有积极意义。

动物实验发现，老年大鼠术后海马部位常出现萎缩、体积减小现象[24]，进一步研究显示可能与海马神经元死亡有关。自噬是海马神经元主要死亡形式，本研究中透射电镜显示模型组自噬小体广泛存在，七氟醚麻醉下行肝叶切除术后大鼠海马神经元确有损伤。自噬属于Ⅱ型程序性细胞死亡，Beclin-1、LC3均属于自噬调控蛋白，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大、Beclin-1表达增加均与自噬体形成正相关[25]。PI3K属于异源二聚体，Akt是其下游效应因子，当信号传导至细胞表面后，PI3K激活，Akt膜转位磷酸化激活，细胞内磷酸化的Akt通过活化下游靶基因发挥效应[26-27]。mTOR属于细胞分裂及合成的调控中心，多种信号均可通过I型PI3K/Akt传递至mTOR启动靶点复合体1(TORC1)，达到激活阈值后阻滞细胞分裂信号传递[28-29]。王建伟等[30]研究显示，DEX可通过上调mTOR蛋白、下调LC3-II蛋白表达减轻大鼠立体肺缺血再灌注损伤引起的自噬，与本研究结果相似。本研究中模型组PI3K、mTOR mRNA和蛋白相对表达量、pAkt/Akt均低于对照组，Beclin-1 mRNA和蛋白、LC3 mRNA相对表达量、LC3-II/LC3-I高于对照组，提示PNCD大鼠海马组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路处于抑制状态，自噬相关基因和蛋白异常高表达。进一步应用不同剂量DEX干预后，PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，自噬相关基因和蛋白表达被抑制，提示PNCD大鼠存在PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制，使老年大鼠海马神经元的形态结构改变，但DEX可逆转该信号通路的抑制作用，从而减轻海马神经元自噬，改善神经功能损伤。