鸡血藤对骨质疏松性骨折大鼠内固定术后恢复的作用及机制*

丁徐 赵毅 黄涛 宋登新

(上海市第一人民医院宝山分院骨科，上海 200940)

骨质疏松症是一种全身性、代谢性骨骼系统疾病，与年龄、性别、种族等因素密切相关，骨折是骨质疏松症最严重的后果[1-4]。鸡血藤来源于豆科植物密花豆的干燥藤茎，具有促进骨折愈合、抗关节炎、促进血管生成等作用[5-8]。Wnt/β-catenin信号通路是细胞生长发育过程中重要的信号转导通路，近年研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与骨折的愈合密切相关，激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进骨折的愈合，使成骨细胞的数量增加，促进新骨的生成[9-13]。本文通过研究鸡血藤对骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后恢复的作用及对大鼠体内Wnt/β-catenin信号通路的调节作用，为骨质疏松性骨折的治疗提供新的参考和依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年雌性SD大鼠，6周龄，体质量(180±20)g，购于中科院上海实验动物中心[许可证号：SCXK(泸)2017-0001]，动物房温度(22±2)℃，湿度(50±10)%，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 主要仪器与试剂 鸡血藤提取物(10∶1)购自武汉市恒沃科技有限公司；双能 X 线骨密度测量仪购自美国GE公司；IN STRON 3367电子拉伸试验机购自英国英斯特朗公司；双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司；LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；RIPA蛋白裂解液、ECL显色液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨质疏松大鼠模型的建立 将60只大鼠随机分为对照组、模型组、鸡血藤低剂量组、鸡血藤中剂量组及鸡血藤高剂量组5组，每组12只。除对照组外，其余大鼠采用大鼠卵巢摘除法建立骨质疏松大鼠模型[14]，具体方法为：腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)对大鼠进行麻醉后，采用背侧入路，常规备皮、消毒后，取后方髂骨嵴上2cm，脊柱旁1cm处做长约2cm纵行切口，依次切开皮肤，皮下和肌层，暴露腹腔，沿输卵管寻找到卵巢组织后，严密结扎输卵管并切除卵巢，逐层间断缝合，术后肌肉注射给予每只大鼠80万U青霉素预防感染，对照组不做处理，然后所有大鼠继续饲养8周，期间大鼠自由饮食。造模结束后应用双能X线骨密度测量仪，检测所有大鼠骨密度，以评价骨质疏松大鼠模型建立是否成功。

1.3.2 骨折大鼠模型的建立及给药 骨质疏松大鼠建模成功后，参照文献方法[15]，除对照组外，其余所有大鼠行右大腿中段外侧纵向皮肤切口，长约3cm，暴露股骨干，在股骨干中段用线锯锯断成横行骨折，用电钻以直径1.0mm克氏针从骨折端钻入远端，穿出股骨髁，复位骨折，从近折端打入克氏针，截断多余克氏针，逐层间断缝合,术中注意保护坐骨神经和肌肉组织，术后肌肉注射给予每只大鼠80万U青霉素预防感染，对照组不做处理。术后第二天开始，鸡血藤低、中、高剂量组根据大鼠体重分别按照50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg灌胃给予大鼠鸡血藤提取物，对照组及模型组灌胃给予等量生理盐水，所有组别每天给药1次，连续给药8周，最后一次给药24h后进行后续实验。

1.3.3 大鼠骨密度的测定 给药结束后，以大鼠右侧股骨骨折端2.0mm×2.0mm 为中心区域，使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通过双能X射线吸收测定法(DEXA)在Hi-res、small animal模式下测量骨痂骨密度。

1.3.4 大鼠股骨生物力学测定 参考文献方法[16]，所有大鼠禁食12h后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后腹主动脉取血处死，取大鼠右侧股骨标本，去除克氏针后，进行三点弯曲试验，加载速度为2 mm/min，计算机记录载荷-位移曲线，然后读出最大载荷和抗弯强度。

1.3.5 苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 大鼠处死后，将右侧股骨骨折端放入4%中性甲醛中固定48h，脱钙液脱钙处理，每周更换一次脱钙液，共脱钙5周，进行常规石蜡包埋，于正中矢状面进行4μm连续切片。然后进行常规HE染色，在显微镜下进行组织病理学观察。HE染色步骤：①脱蜡:将石蜡切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min。②复水：依次置于100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸馏水洗2 min，各两次,然后把水吸干。③苏木精染色：置于苏木精溶液中2 min，自来水流水冲洗，2 min，把水吸干。④分化：1%盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，吸干水。⑤伊红染色:置于伊红溶液中2 min。⑥脱水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min。⑦封片：置于通风橱，待乙醇彻底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待载玻片上残留二甲苯挥干后用中性树胶封片。

1.3.6 Western blot检测大鼠股骨骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平 将大鼠右侧股骨骨折端骨组织在液氮中迅速研磨成粉末，取约200 g粉末加入1mL含PMSF的组织裂解液于冰上静置2 h，采用BCA法测定蛋白浓度，处理好待测样品后，取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，将分离的蛋白电转移至PVDF膜上。封闭液室温封闭1h，经LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗体(1∶1000)孵育后，4℃过夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室温孵育1 h，PBST清洗后显色液显影，利用凝胶成像仪成像后，进行灰度值检测。

2 结果

2.1 骨折前各组大鼠全身骨密度 与对照组相比，模型组及鸡血藤低、中、高剂量组大鼠全身骨密度均显著降低(P<0.05)，且模型组及鸡血藤低、中、高剂量组间大鼠骨密度不存在显著性差异(P>0.05)，提示骨质疏松大鼠模型建立成功，可以继续进行后续实验，见表1。

表1 骨折前各组大鼠全身骨密度Table 1 Whole body bone mineral density of rats in different groups before fracture

2.2 鸡血藤对骨折大鼠内固定术治疗后骨密度的影响 与对照组相比，模型组骨质疏松性骨折大鼠股骨骨折端骨密度显著降低(P<0.05)，提示造模成功；与模型组相比，鸡血藤低、中、高剂量组大鼠股骨骨折端骨密度显著升高(P<0.05)，且随着鸡血藤剂量的增加，骨折大鼠股骨骨密度逐渐升高，提示鸡血藤能够呈剂量依赖性显著增加骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后的骨密度，促进受损骨组织恢复，改善术后骨组织生理结构及功能，见表2。

表2 各组大鼠股骨骨密度Table 2 Bone mineral density of femur in different groups of rats

2.3 鸡血藤对骨折大鼠内固定术治疗后骨生物力学的影响 与对照组相比，模型组大鼠最大载荷和抗弯强度均显著降低(P<0.05)，提示造模成功；与模型组相比，鸡血藤低、中、高剂量组大鼠最大载荷和抗弯强度均显著升高(P<0.05)，且随着鸡血藤剂量的增加，大鼠最大载荷和抗弯强度逐渐升高，提示鸡血藤能够呈剂量依赖性显著改善骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后的生物力学指标，促进骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后骨组织生理结构及功能的恢复，加速新骨的形成，增强骨组织硬度，从而降低大鼠再次骨折风险，改善大鼠的疾病状态及转归，见表3。

表3 各组大鼠最大载荷和抗弯强度Table 3 Maximum load and bending strength of rats in different groups

2.4 组织病理学检查 与对照组相比，模型组大鼠骨痂骨小梁明显减少，散在分布，排列不整齐，成骨细胞明显减少，与模型组相比，鸡血藤各剂量组大鼠骨痂骨小梁明显增多，成骨细胞数量明显增多，且鸡血藤低、中剂量组大鼠骨小梁粗细均匀，排列紧密，部分连成网状，可见新生微小血管，鸡血藤高剂量组大鼠骨小梁增粗明显，生长旺盛，排列致密整齐，可见大量成骨细胞及新生血管，提示鸡血藤能够显著改善骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后骨痂的形成，促进骨组织的恢复及愈合，加快骨折大鼠新骨的形成，见图1。

图1 各组大鼠组织病理学检查结果(HE100×)Figure 1 Histopathological examination of rats in different groups注：A.对照组；B.模型组；C.鸡血藤低剂量组；D.鸡血藤中剂量组；E.鸡血藤高剂量组

2.5 鸡血藤对骨折大鼠内固定术治疗后股骨Wnt/β-catenin信号通路的影响 各组大鼠股骨骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平，见图2。结果表明，与对照组相比，模型组大鼠骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2水平均显著降低(P<0.05)，提示骨质疏松性骨折大鼠骨组织的恢复与Wnt/β-catenin信号通路密切相关；与模型组相比，鸡血藤各剂量组大鼠骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2水平均显著升高(P<0.05)，且LRP5、β-catenin、Runx2水平与鸡血藤剂量表现出依赖性，提示鸡血藤能够显著提高骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2水平，激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进骨折大鼠骨组织修复。

图2 各组大鼠股骨骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平Figure 2 Protein levels of LRP5,β-catenin and Runx2 in femoral fracture tissues of rats in different groups注：与对照组相比，①P<0.05；与模型组相比，②P<0.05

3 讨论

骨质疏松症是一种全身性、代谢性骨骼系统疾病，其病理特征为骨量降低、骨微细结构破坏、骨脆性增加，骨强度下降，易发生骨折。骨质疏松症的发病机制与年龄、性别、种族等因素密切相关，其中绝经后妇女发生率较高[1-3]。骨折是骨质疏松症最严重的后遗症，目前临床上对于骨质疏松性骨折的治疗基本原则是复位、固定、功能锻炼和抗骨质疏松[4]。

鸡血藤来源于豆科植物密花豆的干燥藤茎，中国古典医学著作记载鸡血藤具有活血补血，调经止痛，舒筋活络等作用。近年研究发现，鸡血藤具有促进骨折愈合、抗类风湿性关节炎、改善心肌缺血、促进血管生成、改善小鼠脾脏辐射损伤等药理作用[5-8]。鸡血藤用于治疗骨质疏松等相关疾病的中药成方制剂广泛记载于中医古典医学著作中，近年仲超[17]、宋松[18]等学者研究发现含有鸡血藤的中药方剂在骨质疏松的临床治疗中疗效显著。但鸡血藤对骨质疏松性骨折大鼠内固定术后恢复的作用及机制目前尚罕见明确报道。

Wnt/β-catenin信号通路是细胞生长发育过程中重要的信号转导通路。在发育过程许多不同的细胞和组织中，Wnt/β-catenin整合许多其他通路所传递的信号，并通过多种细胞因子引起一系列信号级联反应，β-catenin既是一个完整的细胞-细胞粘附接头蛋白也是一个转录调节辅因子，存在于多种条件依赖的活化和抑制复合体中，与细胞的生长发育和增殖密切相关，同时也与多种疾病密切相关[9-10]。研究表明Wnt/β-catenin信号通路与骨折的愈合密切相关，激活Wnt/β-catenin信号通路能够促进骨折的愈合，使成骨细胞的数量增加，促进新骨的生成[11-13]。石晓征等[19]发现骨质疏松大鼠体内Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白水平显著降低，梅花鹿茸Ⅰ型胶原能够显著改善大鼠骨密度，其机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关。赵素霞等[20]研究发现去卵巢引起的大鼠骨质疏松的发病机制与Wnt/β-catenin信号通路密切相关，通过调节大鼠Wnt/β-catenin信号通路的表达状态能够显著改善大鼠骨质疏松症状。史岩等[21]也发现在骨质疏松性骨折大鼠疾病恢复过程中，Wnt/β-catenin信号通路扮演着重要角色，调节大鼠该通路相关蛋白的表达，能够促进骨折大鼠的伤口愈合。由此可见，Wnt/β-catenin信号通路在骨质疏松及发病机制及疾病恢复过程中都至关重要，调节该信号通路的表达可能是骨质疏松治疗过程中的关键。

本文研究结果表明：与模型组相比，鸡血藤各剂量组大鼠股骨骨折端骨密度、最大载荷和抗弯强度均显著升高，骨密度是反应骨量的常用指标，骨生物力学中最大载荷及抗弯强度能够直接反应骨质疏松骨骼的骨折风险及骨生理结构及功能，这表明鸡血藤能够显著提高骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后骨组织的生理结构的恢复，促进新骨形成，加速骨折的愈合，降低大鼠再次发生骨折的风险，改善大鼠的疾病转归及预后。组织病理学变化明显改善，鸡血藤各剂量组大鼠股骨骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平均显著升高，提示鸡血藤能够显著提高骨质疏松性骨折大鼠内固定术治疗后骨折组织中LRP5、β-catenin、Runx2水平，激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进骨折大鼠骨组织修复。由于时间及资金限制，本文未能就鸡血藤对Wnt/β-catenin信号通路上下游相关的其他蛋白进行考察，拟在今后的研究中对鸡血藤对骨质疏松大鼠发病机制相关的其他信号转导通路及其靶向调节作用进行深入探讨。

4 结论

鸡血藤能够促进骨质疏松性骨折大鼠内固定术后骨密度、骨生物力学等的恢复，其作用机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路有关。