尿毒症患者血清PTH对大鼠肾小球系膜细胞体外增殖及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响*

2021-06-30陈霓刘秋洪吴丹

西部医学 2021年6期

陈霓刘秋洪吴丹

(1.成都市第三人民医院肾内科，四川成都 610031；2.四川省革命伤残军人医院老年病科，四川成都 610502)

尿毒症是指慢性肾功能衰竭进展至终末期出现的一系列综合征，其病死率较高，且近年来发病率呈上升趋势，极大危害患者生命健康。肾小球疾病是引起尿毒症主要原因，约占54.2%，当肾小球滤过率降低≤50 mL/min时，受高磷血症、维生素D受体缺乏、低钙血症等因素影响，血清甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)水平明显升高[1-2]。血清PTH过度增高不仅可导致肾性骨病，亦可造成红细胞生成系统、免疫系统、心血管系统的负性影响，成为一种新型的尿毒症毒素[3]。而肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells，GMC)是肾小球中重要固有细胞，其过度增殖是肾脏纤维化、尿毒症主要病因[4-5]。目前关于PTH及其对GMC体外增殖、磷脂酰肌醇-3/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路的影响尚缺乏可靠循证支持。本研究从该角度出发，探讨尿毒症患者血清对大鼠GMC体外增殖、PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响，旨在为尿毒症防治提供参考，现报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2015年1月～2018年9月成都市第三人民医院肾内科收治的72例尿毒症患者，尿常规检查提示尿比重固定或下降，尿蛋白阳性，有不同程度血尿和管型尿，可伴有红细胞压积、红细胞计数、血红蛋白、网织红细胞减少。生化检查肾小球滤过率50～90 mL/min，血肌酐、血尿素氮正常为肾功能不全代偿期；肾小球滤过率20～50 mL/min，血肌酐186～442μmol/L、血尿素氮>7.1 mmol/L为肾功能不全代偿期；肾小球滤过率10～20 mL/min，血肌酐451～707μmol/L、血尿素17.9～28.6 mmol/L为肾功能衰竭期；肾小球滤过率<10 mL/min，血肌酐>707μmol/L、血尿素>28.6 mmol/L为肾功能衰竭终末期。患者均未接受活性维生素D治疗，无糖尿病及明显感染，并签署知情同意书，根据血清PTH水平分为正常组16例、轻中度增高组33例、重度增高组23例，本研究经我院伦理委员会审核通过。

1.2 方法

1.2.1 主要材料、试剂与仪器大鼠GMC细胞株；DMEM细胞培养基；胎牛血清；碘化丙啶；兔抗大鼠mTOR抗体；RNA酶；二甲基亚砜；丙酮；胰蛋白酶；兔抗人Caspase-3单抗；FITC标记山羊抗兔IgG；碳酸氢钠干粉；10%山羊血清封闭液；显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(德国Partec公司)；激光共聚焦显微镜(德国CRALZEISS)；酶标仪(美国BIOTEK公司)。以上材料、试剂均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2.2 尿毒症患者血清标本采集常规消毒肘部皮肤，采集尿毒症患者空腹静脉血5 mL，实施离心处理，以免疫化学荧光法检测血清PTH水平，并根据检测结果分为正常组16例(PTH 1～10 pmol/L)、轻中度增高组33例(PTH 11～30 pmol/L)、重度增高组23例(PTH>30 pmol/L)。

1.2.3 大鼠GMC细胞培养大鼠GMC细胞常规培养于含5%～8%胎牛血清和抗生素DMEM细胞培养基，放置于二氧化碳培养箱(5%、37℃)中，当细胞生长至70%～80%融合密度时，应用胰蛋白酶(0.25%)消化传代继续培养，每周传代1～2次，细胞传代培养至第3～8代用于实验。

1.2.4 血清PTH对大鼠GMC细胞增殖的影响取对数生长期大鼠GMC细胞接种于96孔培养板(1×104个/孔)，200 μL/孔，放置于二氧化碳培养箱(5%、37℃)中，24 h细胞贴壁后更换为无血清培养基培养24 h，促使同步静止，弃上清，分别加入20%正常组、轻中度增高组、重度增高组血清的培养液，作用12 h、24 h、48 h，各时间点设置9个复孔。台盼蓝染色，活细胞>95%，干预结束前4 h加入5 g/L噻唑蓝，酶标仪设置690 nm参考波长，读取492 nm波长光密度值，重复3次，取平均数作为最终数值。

1.2.5 血清PTH对大鼠GMC细胞周期影响取对数生长期大鼠GMC细胞接种于6孔板(2×105个/孔)，2 mL/孔，复孔均为3个，放置于二氧化碳培养箱(5%、37℃)中，24 h细胞贴壁后更换为无血清培养基培养24 h，促使同步静止，弃上清，分别加入20%正常组、轻中度增高组、重度增高组血清作用48 h，胰蛋白酶消化处理，PBS洗，70%预冷乙醇悬浮固定细胞，吹打混匀，过夜(-20℃)，去除乙醇，实施2遍PBS洗，再用500 μL PBS重悬细胞，加入12.8 μL核糖核酸和5 μL碘化丙啶避光显色，保存30 min以上，应用流式细胞仪与GMCYCLE软件进行细胞周期分析。

1.2.6 免疫荧光法测定GMC细胞中mTOR的表达取对数生长期大鼠GMC细胞以2×104个/mL接种于盖玻片24孔板(1 mL/孔)中，细胞贴壁后更换为无血清培养基培养24 h，促使同步静止，弃上清，分别加入20%正常组、轻中度增高组、重度增高组血清作用48 h，取出盖玻片，冷丙酮固定处理，山羊血清封闭，加入1∶100兔抗大鼠mTOR抗体，过夜(4℃)，滴加FITC标记山羊抗兔IgG，反应2 h(避光)，甘油封片，显微镜观测并扫描成像。

1.2.7 免疫印迹法测定GMC细胞中Caspase-3表达 GMC细胞接种于6孔板中(1×106个/mL)，2 mL/孔，PBS洗，加入细胞裂解液，冰上静置后实施离心，每孔每次加样10 μL，电泳分离，转移蛋白值膜上，5%脱脂奶粉封闭于4℃下3 h，加入兔抗人Caspase-3单抗，过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记二抗，孵育2 h(室温)，加入化学发光试剂进行定量分析。

1.3 观察指标比较3组12 h、24 h、48 h GMC细胞光密度值；3组GMC细胞周期时相分布；3组mTOR、Caspase-3表达情况。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组性别、体质量、年龄、病程、血肌酐、血尿素氮等，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 3组一般资料比较Table 1 Comparison of general data in three groups

2.2 GMC细胞光密度值正常组、轻中度增高组、重度增高组12 h、24 h、48 h GMC细胞光密度值比较差异显著(P<0.05)；重度增高组12 h、24 h、48 h GMC细胞光密度值均高于正常组、轻中度增高组，且轻中度增高组12 h、24 h、48 h GMC细胞光密度值均高于正常组(P<0.05)；3组GMC细胞光密度值在12 h、24 h、48 h随时间推移逐渐递增(P<0.05)，见表2。

表2 3组GMC细胞光密度值比较Table 2 Comparison of optical density in three groups of gmc cells

2.3 GMC细胞周期时相分布正常组、轻中度增高组、重度增高组GMC细胞周期时相分布比较差异显著(P<0.05)；与正常组相比，轻中度增高组、重度增高组GMC细胞进入S、G2/M期明显增多(P<0.05)；重度增高组GMC细胞进入S、G2/M期细胞多于轻中度增高组(P<0.05)，见表3。

表3 比较3组GMC细胞周期时相分布Table 3 Phase distribution of cell cycle in three groups of GMC

2.4 mTOR、Caspase-3表达情况正常组、轻中度增高组、重度增高组mTOR、Caspase-3表达量比较差异显著(P<0.05)；轻中度增高组、重度增高组mTOR表达量高于正常组，Caspase-3表达量低于正常组(P<0.05)；重度增高组mTOR表达量高于轻中度增高组，Caspase-3表达量低于轻中度增高组(P<0.05)，见表4。

表4 比较3组mTOR、Caspase-3表达情况Table 4 Comparison of expression in three groups of mTOR and Caspase-3

3 讨论

系膜细胞是肾脏3种固有细胞之一，是血浆大分子物质转运通道，具有分泌系膜基质作用，可支持与保护肾小球毛细血管袢，且兼具平滑肌细胞功能，能调节肾小球系膜通道与滤过功能，控制肾小球毛细血管血流量[6-7]。当GMC受到外界因素刺激时，可发生活化、增殖、收缩，形成肌成纤维细胞，造成滤过面积减少，滤过分数降低，肾功能进行性恶化[8-9]。目前普遍认同炎症、免疫、氧化等是以上事件发生的重要原因，但血清对GMC细胞增殖影响尚不明确。有研究指出，GMC细胞增殖与尿毒症病情、预后具有一定相关性[10-11]。本研究结果显示，正常组、轻中度增高组、重度增高组12、24、48 h GMC细胞光密度值依次呈增高趋势(P<0.05)，提示尿毒症患者血清能促进GMC细胞增殖，且血清PTH水平越高，GMC细胞增殖越明显。同时3组GMC细胞光密度值在12、24、48 h随时间推移逐渐递增(P<0.05)，提示GMC细胞增殖呈时间依赖性。

正常情况下，GMC增殖与凋亡处于动态平衡中，以维持肾小球正常滤过功能[12-13]。而细胞生长增殖是通过细胞周期实现的，G1期细胞增多常提示细胞周期进程阻滞，S、G2/M期增多常提示细胞凋亡阻滞[14-15]。本研究结果显示，与正常组相比，轻中度增高组、重度增高组GMC细胞进入S、G2/M期明显增多，重度增高组GMC细胞进入S、G2/M期细胞多于轻中度增高组(P<0.05)，说明尿毒症患者GMC细胞凋亡阻滞，增殖与凋亡平衡紊乱，这是其肾功能衰竭发生的重要原因。相关报道指出，将细胞周期阻滞于G1期可抑制GMC细胞增殖，改善肾脏疾病患者病情[16-17]。此外，Caspase-3是Caspase家族成员之一，激活后可介导结构与调节蛋白的裂解，反映细胞内凋亡机制的启动，在细胞凋亡中具有不可替代作用[18-21]。本研究在以上研究基础上发现，正常组、轻中度增高组、重度增高组Caspase-3表达量依次降低(P<0.05)，与以上研究相符，提示尿毒症患者血清PTH越高，细胞凋亡越少，这符合GMC细胞过度增殖状态。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是机体经典信号通路之一。有学者研究指出[23-24]，PI3K/Akt/mTOR信号通路与肿瘤细胞增殖有关。PI3K磷酸化磷脂酰肌醇(PI)的肌醇环上有5个可被磷酸化位点，其中PI-3-磷酸能刺激细胞迁移，PI-3，4-二磷酸可促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡，PI-3，4，5-三磷酸能调节细胞黏附、生长、存活，因此PI3K/Akt/mTOR信号通路与GMC细胞增殖有关[25-28]。钟利平等[31]指出，肾纤维化模型小鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路表达量较高。张春江等[30]研究指出，下调PI3K/Akt/mTOR信号通路可抑制大鼠GMC细胞增殖。本研究结果显示，正常组、轻中度增高组、重度增高组mTOR表达量依次升高(P<0.05)，说明尿毒症患者血清PTH可调控PI3K/AKT/mTOR信号通路表达，这可影响GMC细胞增殖情况，故推测PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂可抑制GMC细胞增殖，有利于缓解患者病情，但详情及可靠性有待大样本量的深入研究。慢性肾脏病患者通常在3期逐渐出现PTH升高，本研究不足之处在于，纳入患者中较多PTH完全正常的患者，可能造成纳入样本的偏倚，有待后续的进一步研究。