分离自1例慢性阻塞性肺疾病患者的Aspergillus lentulus在蜡螟模型上的毒力初探

谢韵 张丽娟 帕丽达·阿布利孜

(新疆医科大学第一附属医院皮肤科，乌鲁木齐 830011)

自二十世纪八十年代以来，随着免疫缺陷患者数量的增加、病原真菌检测和鉴定技术的进步，侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)的发病率在全球范围内逐年上升[1]。以往IFI最常见的病原体是酵母菌，特别是念珠菌属和隐球菌属。近几十年来，曲霉已成为IFI的主要病原之一[2]，主要由烟曲霉引起[3]。但是，近年来一些新发现的曲霉菌也导致严重的IFI,这些新发现的曲霉菌与烟曲霉表型相似，在遗传和形态学上难以区分[4-5]。其中有一种于2005年首次被描述,因其产孢速度慢被命名为A.lentulus[6]。文献报道[7-9]，至今为止全世界共有19例A.lentulus感染的报道，绝大多数被感染者是因肿瘤接受化疗的免疫功能受损的患者。该菌在48℃不能生长，体外抗真菌药物敏感试验发现其对多个抗真菌药具有高的MIC(最低抑菌浓度)，尤其是唑类[10-12]。本研究A.lentulus临床株分离于长期用糖皮质激素的慢性阻塞性肺疾病患者痰液，患者被诊断IFI后积极抗真菌治疗，但最终死亡。本课题组关注该菌感染的死亡率高是否与毒力高有关。文献复习未发现关于A.lentulus的毒力相关研究，本研究设以大蜡螟为感染模型[13-15]，通过生存时间、组织病理、真菌负载量等综合评价A.lentulus的毒力。

1 材料与方法

1.1 材料

实验菌株Aspergilluslentulus临床株(编号：XYZ 10198)、A.lentulus标准株(菌号：XYZ 10200)、烟曲霉(菌号：XYZ10186)、白念珠菌(茵号：XYZ9013)来自新疆医科大学第一附属医院皮肤科真菌室。

实验动物 蜡螟5龄幼虫125只，平均重量300 mg，长度2.5 cm，颜色呈乳白色无黑点，购自天津惠裕德生物科技有限公司。

实验试剂 沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(SDA)购自美国BD公司；苏木素-伊红染液购自华普泰克生物科技有限公司；真菌荧光染色液购自南京汉瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

构建蜡螟感染模型 分组：将125只蜡螟随机分成5组，即烟曲霉组(A.fu)、白念珠菌组(Ca)、A.lentulus临床组、A.lentulus标准组和PBS组。每组15只观察生存时间，其余解剖。将上述4组真菌分别接种于SDA上37 ℃培养。其中白念珠菌培养3 d，烟曲霉及A.lentulus培养7 d。用无菌的PBS将各个菌落洗脱，制成相对应1.0×106CFU/mL孢子悬液，蜡螟左下腹尾足处注入40 μL。PBS组注射40 μL无菌PBS作为对照。放入37℃培养箱培养并制作生存曲线。

制作蜡螟肠道组织病理切片及形态学观察 取感染24 h的各组蜡螟幼虫，在尾足处左下腹注入10%甲醛溶液，4%多聚甲醛溶液浸泡3～7 d，取其肠道组织进行常规脱水、包埋、切片并进行苏木素-伊红(HE)染色。

测定真菌逆培养阳性率及蜡螟肠道真菌载量无菌条件下，将感染的蜡螟肠道组织分成3段接种于SDA试管中，于37℃恒温箱培养1周，观察试管中真菌菌落。同时将蜡螟肠道组织匀浆后，按照倍比稀释法将虫体体液稀释，取100 μL虫体液均匀涂布在SDA培养基上，于37℃ 培养48 h计数菌落。

真菌荧光染色各组真菌形态 将上述SDA试管中真菌菌落，用无菌接种环刮取少许在载玻片上，将染液均匀滴在菌落上，静置1 min后荧光显微镜下拍摄真菌形态。

统计学处理 应用Graphpad prism 8.0统计软件，绘制生存曲线，采用log-rank检验；应用SPSS 22软件，蜡螟肠道真菌载量的比较采用双因素重复测量方差分析；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 蜡螟感染各组真菌后的生存情况(见表1、图1)

表1 各组不同时点蜡螟幼虫存活数

图1 蜡螟在不同时间段的生存率

同一时间点，A.L临床组与A.L标准组蜡螟幼虫存活数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，Ca组与A.fu组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。A.L临床组与A.L标准组分别与Ca组或A.fu组同一时间点进行两两比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。表中结论及生存曲线走势得出，注射A.L临床组与A.L标准组的蜡螟存活数比Ca组与A.fu组多。

2.2 病理组织切片结果(见图2)

不同菌种感染的蜡螟肠道。A.L临床组(见图2A)与A.L标准组(见图2B)：肠壁结构大致正常，局部可见肠壁水肿，肠腔内可见少量淋巴组织细胞； A.fu组(见图2C)：肠上皮黏膜内可见大量淋巴组织细胞及孢子，少量嗜中性粒细胞，未见正常绒毛样结构； Ca组(见图2D)：肠壁结构破坏，肠上皮结构紊乱，肠腔内可见大量孢子及炎症细胞浸润。

图2 注射不同组真菌蜡螟肠道损伤情况(HE×200).A. 感染A. lentulus临床株的蜡螟肠道；B. 感染A. lentulus标准株的蜡螟肠道；C. 感染烟曲霉的蜡螟肠道;D. 感染白念珠菌的蜡螟肠道. a. 轻度水肿；b. 孢子及菌丝 图3 各组真菌逆培养菌落形态. A. A.L临床组; B. A.L标准组; C. 烟曲霉组; D. 白念珠菌组; E. PBS组

2.3 蜡螟真菌逆培养阳性率及肠道真菌载量

A.L临床组、A.L标准组、烟曲霉组、白念珠菌组均可见菌落生长，PBS组未见菌落生长(见图3)。

A.L临床组和A.L标准组感染蜡螟幼虫，在24 h内各个时间点测得的肠道真菌负载量大致相同(见图4)。两组分别与Ca组和A.fu组比较，在各个时间点差异均有统计学意义(见表2，P<0.05)。随着时间的不断增加，各组真菌载菌量有不同程度的增加，其中Ca组最为迅速，其次为A.fu组，最后为A.L临床组和A.L标准组。其中A.L临床组分别与Ca组、A.fu组，以第12 h和第18 h差异最为明显。

图4 蜡螟肠道各时间点真菌负载量曲线

表2 蜡螟肠道组织各时间点真菌负载量

2.4 真菌荧光染色结果

刮取SDA试管中菌落于载玻片上染上色进行观察(见图5)。A.lentulus临床株、标准株，菌丝较多，孢子较少且发育缓慢，少见曲霉头。白念珠菌孢子较多。烟曲霉，孢子多，可见曲霉头。

图5 荧光显微镜下各真菌形态(×400). A. A. lentulus临床株；B. A. lentulus标准株；C. 白念珠菌；D. 烟曲霉. A、B. 菌丝为主；C、D. 孢子为主

3 讨 论

小鼠感染模型通常被视为真菌毒力研究的金标准，因经济和伦理的高要求哺乳动物在感染动物实验中的使用受到了限制，特别是需要做大规模菌株动物实验时费用高。鉴于以上问题，微型宿主模型，主要是无脊椎动物，已被探索作为真菌感染的替代模型。这些模型包括阿米巴、线虫、黑腹果蝇和大蜡螟幼虫等[16-18]。大蜡螟的幼虫已被广泛用于评估微生物病原体的毒力和抗菌药物疗效的替代模型[18-19]。在念珠菌属[19-20]、曲霉属[21]、新生隐球菌[22]等致病真菌研究中是被认可的模型动物，蜡螟模型实验数据与小鼠模型实验数据有较强的相关性[23]。与其他非哺乳动物模型相比，大蜡螟感染模型具有以下优势：价格低廉，不受伦理限制，幼虫体积较大，能准确注射病原菌接种量，37℃的高温能存活，相当于哺乳动物宿主的温度。此外，幼虫的免疫系统与哺乳动物的先天免疫系统相似，其血细胞采取与人类中性粒细胞相似的机制来识别真菌细胞，主要作用包括病原体识别受体、吞噬作用和氧化爆发途径中超氧化物的产生[17,24,25]。不同剂量感染后的蜡螟死亡率或LD50的测定通常被用作评估微生物毒力的主要参数，并用来对菌株的相对毒力进行排序[17]。在没有死亡率的情况下，真菌负荷可用于比较菌株之间的毒力[18]。因此，大蜡螟的幼虫越来越多地被用作微生物感染的模型也就不足为奇了。

A.lentulus感染好发于接受免疫抑制治疗或免疫功能受损的患者，侵袭性曲霉病最常见于呼吸道的感染，患者易发生播散性曲霉病，并伴有心脏、中枢神经系统、肝脏、肠道和其他器官的受累[26]。本课题组前期对蜡螟幼虫生存率、体表黑色素化及活动度研究显示A.lentulus的毒力比烟曲霉和白念珠菌等重要医学真菌弱[29]。本研究的毒力实验使用存活曲线、组织病理学和真菌负载量进一步验证了以往的研究结果。用106CFU/mL的不同真菌活化孢子菌悬液感染蜡螟幼虫，结果显示A.lentulus临床株和标准株毒力比白念珠菌和烟曲霉弱。幼虫肠道组织损伤在接种前两者的幼虫中较不明显，表现为肠道结构大致正常，局部轻度水肿伴少量菌丝、孢子及炎症细胞浸润；后两者表现为大量炎症细胞浸润伴随真菌孢子堆积，导致肠道组织结构紊乱。与对照菌株相比，A.lentulus临床株和标准株的低真菌负载量显示出较低的感染程度。本研究中白念珠菌的真菌负载量比烟曲霉多，可能是因为在一定时间内，白念珠菌较烟曲霉生长快，并不代表白念珠菌毒力比烟曲霉强。

真菌毒力的增强或减弱由若干复杂因素决定，如真菌形态发生、表面抗原物质(β-葡聚糖，几丁质，甘露聚糖等)、黏附因素、色素、细胞因子，次生代谢产物及调控基因等，因此，真菌毒力研究及致病性被研究者关注。真菌的毒力和宿主的免疫状态共同决定了是否发生真菌感染以及真菌感染的严重程度[15,25,27]。当机体受到外来微生物感染时，便会启动先天性免疫系统通过其表面的模式识别受体或感应系统激活炎症反应，促进炎症因子IL-1β，IL-18 等释放[28]。本研究初步探究了A.lentulus的毒力,结果显示为低毒力菌株，与现存临床病例报道的高死亡率相矛盾。我们推测造成患者死亡的原因不是该菌的毒力，而是对多种抗真菌药物不敏感，死亡率高是否与该菌的耐药基因相关有待进一步研究。