基于熵权法计算权重系数的正交试验优化益根调理膏醇提工艺

蒋 林，郭勇秀，李芳婵，庞晓云，魏博伟，随家宁

（1.广西中医药大学药学院，南宁 530001；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530001；3.广西中医药大学制药厂，南宁 530001）

益根调理膏是广西中医药大学通过挖掘《本草纲目》溲数遗尿古方演绎出来的民间验方，由黄精、玉竹、覆盆子、桑葚、补骨脂、益智、韭子、火麻仁、山楂9味药组成，对治疗老年人夜间多尿症有显著疗效。前期课题组经动物试验表明，益根调理膏能降低肾阳虚多尿动物的尿量，提高血清中醛固酮，降低BUN水平，对肾有保护作用。中药多以汤剂为主，汤药长期服用，脾胃不适，且口感不佳，难以长期服用，临床使用存在诸多不便。为了增加患者的依从性及便捷作用，拟开发成院内制剂益根调理膏，现针对该方法的提取工艺进行研究。

中药复方成分复杂，对其提取工艺进行优化及合理选择评价指标一直是同行研究热点，比较成熟的优化方法有正交试验及星点-响应面优化法，评价指标多数以具有与药效相关及专属性较强的成分为主，但目前并没有一个明确的标准。因此本试验采用正交试验，以乙醇体积分数、溶剂量、提取时间、提取次数为考察因素，以总黄酮、补骨脂素和圆柚酮提取量为指标，再根据熵权法计算权重系数确定各指标综合评分，优化益根调理膏醇提工艺，为该制剂后期开发成院内制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 药材

补骨脂素，C12J8Q39802，HPLC≥98%（经面积归一法测定），上海源叶生物科技有限公司；圆柚酮，4674-50-3，纯度以98%计（经面积归一化法测定），美国Sigma公司；芦丁，批号170506，供含量测定，纯度为＞99%，中国食品药品研究院。

覆盆子为蔷薇科植物华东覆盆子（Rubus chingiiHu）的干燥果实，批号170801，南宁生源中药饮片有限责任公司；补骨脂为豆科植物补骨脂（Psoralea corylifolialL.）的干燥成熟果实，批号161101，南宁市万药堂药业有限公司；益智为姜科植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果实，批号170401，南宁市万药堂药业有限公司；韭子为百合科植物韭菜（Allium tuberosumRottl.ex Spreng.）的干燥成熟种子，批号170101，南宁生源中药饮片有限责任公司；山楂为蔷薇科植物山楂（CrataeguspinnatifidaBge.）的干燥成熟果实，批号170404，南宁市万药堂药业有限公司；火麻仁为桑科植物大麻（Cannabis sativaL.）的干燥成熟果实，批号17032301，广西宝正药业有限公司。

1.2 仪器

752型紫外可见分光光度仪，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ME104E电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SG250HE超声仪，40 kHz，200 W，上海冠特超声仪器有限公司；LC-2030C3D高效液相色谱仪，岛津企业管理有限公司。

1.3 试剂

甲醇，批号2016121201，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；甲醇，色谱纯，Fisher；氢氧化钠，分析纯，批号1508151，西陇化工股份有限公司；亚硝酸钠，分析纯，批号2017030501，天津博迪化工股份有限公司；硝酸铝，分析纯，批号20170517，天津市大茂化学试剂厂；石油醚，沸程60～90℃，分析纯，批号170601，西陇科学股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 评价指标的确立及评价方法 由于中药复方具有多成分、多靶点作用的特点，不能仅仅以其中某一种成分的含量为评价指标，多成分多指标综合评价复方的内在质量应是发展的方向。覆盆子、补骨脂、益智、韭子、火麻仁、山楂6味药均含有黄酮类化合物，是主要功效成分之一，补骨脂、韭子的香豆素类化合物为主要功效成分，益智温肾缩尿的重要成分是圆柚酮，故选择以总黄酮、补骨脂素和圆柚酮提取量的综合评分为益根调理膏醇提工艺的评价指标。

1.4.2 总黄酮测定

1）样品与供试品制备。样品：按比例称取覆盆子、韭子、益智、山楂、火麻仁药材，加10倍60%乙醇回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压旋转蒸发回收乙醇，浓缩至稠膏，备用。

供试品溶液：取样品适量（相当于5.8 g生药量），精密称定，加水至30 mL，置于分液漏斗中，加石油醚（60～90℃）30 mL，萃取3次，水层蒸干，残渣加甲醇溶解并过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，即得。

2）标准曲线绘制。取芦丁适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含芦丁对照品0.248 3 mg的溶液，即为对照品溶液。精密量取芦丁对照品溶液（0.248 3 mg∕mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%氢氧化钠10 mL，加水至刻度线，放置15 min，以相应试剂作空白，于500 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，以浓度X为横坐标，进行回归分析，结果在9.93～59.60μg∕mL与吸光度呈良好线性关系，回归方程为A=11.346X-0.001 5（R2=0.999 9）。

3）稳定性试验。精密量取供试品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，自“加水至6 mL”起，按“标准曲线绘制”方法操作，分别于0、5、10、15、20、30 min测定吸光度，计算RSD。结果RSD为2.03%，表明供试品溶液在30 min内稳定性良好。

4）精密度试验。精密量取2 mL芦丁对照品溶液，自“加水至6 mL”起，按“标准曲线绘制”方法操作测定吸光度，连续测定6次，计算RSD。结果RSD为0.94%，表明仪器精密度良好。

5）重复性试验。取样品适量（相当于5.8 g生药量，6份），制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，自“加水至6 mL”起，按“标准曲线绘制”方法操作测定吸光度，计算RSD，结果RSD为1.29%，表明本方法的重现性良好。

6）加样回收试验。取样品适量（相当于2.9 g生药量，6份），精密加入芦丁对照品，按“1.4.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，自“加水至6 mL”起，按“标准曲线绘制”方法操作测定吸光度，计算加样回收率。结果平均回收率为99.3%，RSD为0.699%，表明该方法回收率符合要求。

1.4.3 补骨脂素含量测定

1）色谱条件。PHenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相乙腈-水（38∶62），流速1 mL∕min，柱温30℃，检测波长244 nm，进样量5μL。

2）补骨脂素对照品溶液。取补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含补骨脂素对照品0.098 5 mg的溶液，备用。

3）供试品溶液制备。取“1.4.2”项下样品适量（相当于总药材5.8 g），置于蒸发皿中蒸干，加甲醇溶解，过滤，滤液置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，即得。

4）标准曲线绘制。精密取2、4、6、8、10、12μL补骨脂素对照品溶液，按色谱条件操作，记录峰面积。以质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。回归方程为Y=6 810 230X+41 377.0（R2=0.999 9）。结果表明在0.197～1.182μg与峰面积呈良好线性关系。

5）稳定性试验。取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，计算补骨脂素的含量及RSD。结果RSD为0.28%，表明样品在24 h内稳定性良好。

6）精密度试验。取补骨脂素对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，RSD为0.05%，表明仪器精密度良好。

7）重复性试验。取样品适量（相当于5.8 g生药量）（6份），制备供试品溶液，进样测定记录峰面积，计算补骨脂素的含量，计算RSD。结果RSD为1.42%，表明方法重复性良好。

8）加样回收试验。取样品适量（相当于2.9 g生药量），共6份，分别精密加入补骨脂素对照品，制备供试品溶液，进样测定记录峰面积，计算加样回收率。结果样品的平均回收率为100.0%，RSD为0.93%，表明该测定方法符合要求。

1.4.4 圆柚酮含量测定

1）色谱条件。PHenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相乙腈-水（56∶44），流速1 mL∕min，柱温30℃，检测波长239 nm，进样量10μL。

2）对照品溶液制备。取圆柚酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.055 mg圆柚酮对照品的溶液。

3）标准曲线绘制。精密吸取4、6、8、10、12、14μL圆柚酮对照品溶液注入高效液相色谱仪中，进样测定记录峰面积。以质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。回归方程为Y=2 094 970X-2 128.11（R2=0.999 9）。表明圆柚酮在0.220～0.770μg与峰面积呈良好线性关系。

4）稳定性试验。取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积。结果RSD为1.92%，表明样品在24 h内稳定性良好。

5）精密度试验。取圆柚酮对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果RSD为0.45%，表明仪器精密度良好。

6）重复性试验。取样品适量（相当于5.8 g生药量，6份），制备供试品溶液，进样，记录峰面积，计算RSD。结果RSD为2.02%，表明方法重复性良好。

7）加样回收试验。取样品适量（相当于生药量2.9 g，6份），精密加入圆柚酮对照品，按供试品溶液制备方法操作，计算加样回收率。结果平均回收率为101.8%，RSD为1.38%，表明该方法回收率符合要求。

2 结果与分析

根据文献和预试验考察结果，影响醇提工艺的主要因素有乙醇体积分数、溶剂量、提取时间及提取次数，根据单因素考察结果，采用正交设计，选择L（934）正交表，对益根调理膏醇提工艺进行优化，设计因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

按比例称取覆盆子、韭子、益智、山楂、火麻仁药材9份，按L（934）正交表条件进行试验，试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验结果（n=3）

表3 方差分析

OD=［（总黄酮含量∕总黄酮含量最大值）×M1+（补骨脂素含量∕补骨脂素含量最大值）×M2+（圆柚酮含量∕圆柚酮含量最大值）×M3］×100%（M1总黄酮权重；M2补骨脂素权重；M3圆柚酮权重，均由熵权法求取）。结果按熵权法计算权重，M1、M2、M3分别为0.336 9、0.335 1、0.328 0，将试验结果进行综合分析，并对结果进行直观分析和方差分析，各因素对提取工艺的影响为提取次数＞乙醇体积分数＞溶剂量＞提取时间。提取次数、乙醇体积分数及溶剂量对提取量的影响显著，提取时间的影响不显著，最优因素水平组合为A3B3C1D2，即乙醇体积分数为70%，溶剂量为12倍，提取时间1.0 h，提取2次。

按比例取补骨脂、覆盆子、益智、火麻仁、山楂、韭子3份，按上述提取工艺进行提取，计算总黄酮、补骨脂素、圆柚酮提取量，结果见表4。由表4可知，总黄酮、补骨脂素、圆柚酮提取量接近正交试验中的最大值，表明该提取工艺合理。

表4 验证试验结果（n=3）

3 讨论

益根调理膏中覆盆子的主要化学成分为黄酮、生物碱和酚酸类等，覆盆子70%乙醇提取物对小鼠肾阳虚有一定的改善作用，氯仿部位和乙酸乙酯部位能改善肾阳虚型痴呆大鼠的学习记忆能力，覆盆子素补肾活性强［1-5］。补骨脂主要含香豆素类、黄酮类等化学成分，香豆素类对肾阳虚、脾虚有改善作用，补骨脂乙醇提取物与其温补肾阳作用有关［6，7］。益智主要化学成分为萜类、黄酮类等，益智醇提物能减少肾阳虚大鼠的尿量，圆柚酮为其温肾缩尿的主要成分之一［8-13］。韭子含有生物碱类、香豆素类、皂苷、氨基酸和挥发油等成分，韭子70%乙醇提取物能改善肾虚和肾阳虚作用，具有温肾助阳的功效［14-16］。火麻仁主要活性成分为油脂、蛋白质和挥发油等［17-19］。山楂主要含有黄酮类、维生素类、糖类和矿物质等活性成分，其黄酮类具有保肝和抗氧化等功效［20-22］。因此根据处方中药有效成分的理化性质以及有效部位特点，结合影响药物醇提工艺的因素［23，24］，以总黄酮、补骨脂素、圆柚酮为考察指标，乙醇为溶媒，以乙醇体积分数、溶剂量、提取时间、提取次数为因素，采用正交试验结合熵权法计算各指标权重系数优化醇提工艺参数。

采用高效液相色谱法对补骨脂素和圆柚酮进行测定、紫外分光光度法对总黄酮进行测定，并对测定方法进行了方法学研究，研究结果表明所采用的方法均满足药典规定的方法学验证要求。

补骨脂素和圆柚酮在同一个色谱条件中以梯度洗脱难以达到分离要求，对其含量测定造成一定影响，因此为了使其含量测定更加稳定、分离效果更好，设计了两个等梯度洗脱法色谱条件。

熵权法是一种客观赋权法，仅依赖于数据本身的离散性［25］。本研究选用熵权法确定醇提工艺各指标的客观权重，根据权重得出综合指标，能更全面反映各成分在提取过程中的提取效果，引入熵权法确定权重避免了主观确定权重的随意性，具有直观性好、灵活方便等优点。