长链非编码RNA表达失调在糖尿病肾病发病机制中的研究进展

郭弋凡，赵文景，王梦迪，崔方强，孟元，孙雪艳，刘志强，王玉锋，王亚伟，沈晓琼，董晋舟

(首都医科大学附属北京中医医院肾病科，北京100010)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病代谢异常引发的肾小球硬化症，是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病的主要病因，也是导致其死亡的重要原因［1］。据报道，30%～40%的糖尿病患者逐渐发展为DN，其中约50%的DN患者进一步发展为终末期肾病，需要透析或肾移植，给患者家庭和社会带来沉重负担［2－3］。DN发病机制复杂，与炎症反应、氧化应激、血流动力学改变、糖代谢紊乱、环境因素、表观遗传等因素有关［4－5］。目前，现代医学对其治疗主要为降压、降糖、降脂及有效地生活调控以减少蛋白尿和延缓疾病进展，虽然血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂均能有效降低患者的高血压和微量白蛋白尿，但不能有效预防蛋白尿发生，无法逆转甚至阻止其进展为终末期肾病［6］。近年来，新型降糖药胰高血糖素样肽－1受体激动剂和钠－葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂已在大规模随机对照试验中显示出良好疗效，但仅限于降低蛋白尿发生率，对肾功能保护作用有限［7－8］。因此，迫切需要寻找干预DN发生和进展的新靶点。研究表明，DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、微RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA(long non－coding RNA，lncRNA)等表观遗传因素均参与了DN的发生［9］，且lncRNA异常表达通过炎症反应、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡和自噬等途径促进DN的发展，其表达异常对疾病的早期诊断和靶向治疗具有重要意义，已成为近年DN领域的研究热点［10－14］。现就lncRNA表达失调在DN发病机制中的研究进展予以综述，以期为DN的治疗和预防提供新思路。

1 lncRNA

LncRNA是一类长度超过200个核苷酸，但不具有蛋白质编码能力的RNA，可直接与多个RNA分子或蛋白质相互作用，参与调控表观遗传、转录和转录后水平的基因表达［15］。LncRNA占整个哺乳动物基因组转录的80%［16］，根据其在基因组上相对于蛋白编码基因的位置差异可分为5类:反义lncRNA、内含子lncRNA、增强子lncRNA、双向lncRNA及基因间lncRNA［17］。越来越多的证据表明，lncRNA是疾病状态下各种生理和病理过程的关键调节因子，包括细胞增殖、凋亡和自噬［18－19］;同时能参与诱导多能干细胞活化和染色质修饰［20］。此外，lncRNA亦可通过DNA甲基化、信使RNA转录、选择性剪接、翻译控制、表观神经调节、基因组印迹和染色质修饰等方式参与不同的生物学过程［21－22］。随着基因组学的进步，高通量测序、原位杂交技术等的不断成熟，lncRNA已被证实在肿瘤、神经和代谢性疾病中表达失调［23－25］。虽然其在DN领域研究相对较晚，但已有诸多文献报道lncRNA母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、lncRNA肺腺癌转移相关转录子1(metastasis－associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)、lncRNA生长阻滞特异性转录本5(growth arrest－specific transcript 5，GAS5)等异常表达参与DN的进展［10，15－16］。因此，lncRNA可能会成为未来干预DN进展的潜在靶点。

2 lncRNA异常表达参与DN的发病机制

有证据表明，lncRNA在DN病理生理过程中起重要作用。如有基因芯片发现，野生型小鼠与2型糖尿病模型小鼠中有1 746个lncRNA差异表达［26］，且它们有潜在的顺式作用。另有RNA序列分析显示，与对照小鼠相比，db/db－DN小鼠中有88个lncRNA上调和68个lncRNA下调，且其中10个在罗格列酮治疗后恢复了正常表达，为DN药物开发提供了新的分子调控途径［27］。事实上，lncRNA异常表达参与DN发生发展的各个病理过程。现对40个lncRNA在DN中的异常表达及其可能机制进行阐述，其中27个lncRNA表达上调，11个表达下调，2个(MEG3、尿路上皮癌相关基因1)表达仍有争议，见图1。

图1 lncRNA在DN中异常表达及其参与的机制

2.1 促进DN炎症反应的发生 炎症反应在DN发生和进展中起重要作用，单核细胞趋化蛋白、肿瘤坏死因子－α、白细胞介素(interleukin，IL)－1β和IL－6等炎症因子已被证实在体内外参与DN发病过程［28］。研究发现，lncRNA Blnc1水平在DN患者血清和模型大鼠中升高，抑制其表达可介导红系衍生的核转录相关因子/血红素加氧酶1和核因子κB通路显著减轻肾脏的炎症反应、氧化应激和纤维化［29］。Shi等［30］证实抑制lncRNA尿路上皮癌相关基因1表达可降低肿瘤坏死因子－α和IL－6的水平，减轻DN大鼠肾脏病理损伤及炎症反应，其机制可能与抑制磷脂酰肌醇－3－激酶(phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)通路有关。Zhang等［31］表明，lncRNA 9884在db/db－DN小鼠中高表达，而特异性沉默其表达可降低单核细胞趋化蛋白－1水平，抑制巨噬细胞浸润，减轻肾脏炎症反应。Peng等［32］研究发现，lncRNA NONHSAG053901在DN小鼠和体外系膜细胞中过表达可刺激早期生长反应因子－1(early growth response factor－1，Egr－1)/转化生长因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)通路促进炎症因子产生，介导体内外炎症反应、纤维化和增殖的发生。此外，Ji等［33］研究证实lncRNA Gm6135作为竞争内源性RNA负调控miR－203，进而刺激Toll样受体4表达参与DN炎症反应。Yi等［34］研究发现，lncRNA Gm4419高表达通过核因子κB/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3通路参与高糖状态下肾脏系膜细胞炎症、增殖和纤维化。Zhang等［35］研究表明，lncRNA心肌梗死相关转录本在高糖诱导的足细胞中显著表达，缺乏心肌梗死相关转录本可通过miR－130a－3p/Toll样受体4诱导炎症介质(肿瘤坏死因子－α、IL－1β和IL－6)释放减少，从而减轻高糖诱发的足细胞炎症反应。

以上结果表明，参与炎症反应的lncRNA均在DN患者或小鼠中高表达，其通过诱导核因子κB、PI3K/Akt、TGF－β等通路或竞争性结合miRNA调节下游炎症因子的表达，进而加速DN进展，因此抑制这些lncRNA表达可为DN治疗提供新线索。

2.2 促进DN氧化应激 氧化应激是体内活性氧化物产生多于清除、氧化系统和抗氧化系统失衡的病理状态，在DN过程中起重要作用［36］。已有研究表明，lncRNA GAS5在高糖诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK－2细胞)中表达下调，其过表达可靶向miR－452－5p，进而降低肿瘤坏死因子－α、IL－6、单核细胞趋化蛋白－1及活性氧类水平，抑制HK－2细胞氧化应激和炎症反应，为DN治疗提供新思路［37］。近年研究发现，lncRNA癌易感性候选基因2在DN患者血清和高糖诱导的系膜细胞中表达减少，上调其表达可通过miR－133b/叉头框转录因子O1轴抑制氧化应激、系膜细胞增殖和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)积累，为DN的发生发展提供新机制［11］。目前，参与氧化应激的lncRNA报道较少，未来需进一步探索更多有效的调控靶点。

2.3 参与DN上皮－间充质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的发生 EMT是上皮细胞在各种理化因素作用下失去其表型特征向间充质细胞转化的现象，是足细胞损伤的早期事件，也是DN重要的特征之一［38］。已有研究发现，在高糖条件下，lncRNA ARAP1(ArfGAP with RhoGAP domain，ankyrin repeat and PH domain 1)和lncRNA ARAP1－AS2(antisense RNA 2)在HK－2细胞中表达增加，且lncRNA ARAP1－AS2过表达加快了EMT进程，而ARAP1基因敲除可减少高糖诱导的HK－2细胞EMT和纤维化发生［39］。Gao等［40］发现，lncRNA NR_033515在DN患者血清中表达增加能降低上皮细胞标志物上皮钙黏附分子抗体、升高间充质细胞标志物波形蛋白的表达水平，且NR_033515通过靶向miR－743b－5p调节p38、凋亡信号调节激酶1、纤维连接蛋白、α－平滑肌肌动蛋白的表达，促进细胞增殖、纤维化和EMT过程。此外，高糖可上调lncRNA MALAT1表达并激活Wnt/β联蛋白(β－catenin)通路诱导HK－2细胞EMT［41］，且能通过竞争性结合miR－145促进靶基因锌指E盒结合蛋白(zinc finger E－box binding homeobox，ZEB)2表达诱导EMT和纤维化发生［42］。Cai等［43］研究表明，lncRNA CLYBL－AS2在DN中表达增加且与疾病严重程度相关，而中药黄连可通过miR－204－5p－SNAI1轴抑制CLYBL－AS2表达，从而改善HK－2细胞EMT和纤维化。Meng等［44］证实，lncRNA ZEB1－AS1在高糖处理的HK－2细胞中表达减少，其过表达可通过调节miR－216a－5p/骨形成蛋白7轴抑制高糖诱导的EMT和纤维化。可见，EMT在DN发病机制中起关键作用，而lncRNA异常表达通过靶向下游信号分子的表达参与EMT发生，为DN的防治提供新思路。

2.4 通过多种通路诱导DN细胞增殖和纤维化肾小球系膜病变是DN突出的病理改变之一，在疾病早期就存在系膜细胞增殖和纤维化、ECM增多的特征［45］。Li等［14］研究发现，lncRNA LINC00968在db/db－DN小鼠肾组织和高糖诱导的系膜细胞中高表达，且通过募集Zeste同源物增强子2基因抑制p21蛋白表达，进而加速系膜细胞增殖和纤维化。Chen等［46］研究认为，lncRNA H2K2(histocompatibility 2 K region locus 2)过表达可通过miR－449a(b)/Trim11/促分裂原活化的蛋白激酶通路促进系膜细胞增殖，加速DN进展。Zhang等［47］表明，lncRNA Rpph1(ribonuclease P RNA component H1)在DN小鼠肾组织和人肾小球系膜细胞中过表达，其通过抗人半乳糖凝集素－3/促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶通路促进系膜细胞增殖和炎症反应。Zhu等［48］研究表明，lncRNA HOXA末端转录本反义RNA在db/db－DN小鼠和高糖处理的系膜细胞中表达上调，而HOXA末端转录本反义RNA基因敲除可靶向miR－455－3p/Wnt2B轴抑制系膜细胞增殖和ECM积聚。Zhang等［49］发现，lncRNA 150Rik在db/db－DN小鼠肾组织和高糖培养的系膜细胞中高表达且通过miR－451/胰岛素样生长因子1受体/p38促分裂原活化的蛋白激酶通路促进系膜细胞增殖。Yang等［50］证实，lncRNA Arid2－IR在DN小鼠肾脏中高表达，且Egr－1与基因启动子结合上调Arid2－IR表达可促进ECM产生和肾纤维化。Li等［51］发现，DN患者血清及肾小球系膜细胞中lncRNA细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B－反义RNA表达上调，沉默其表达可通过miR－424－5p/高迁移率族蛋白2轴抑制系膜细胞增殖和ECM积累。Cheng等［52］表明高糖条件下，lncRNA Dlx6os1(distal－less homeobox 6－opposite strand 1)在小鼠系膜细胞中表达增加，抑制其表达可减少系膜细胞增殖和纤维化，增加细胞凋亡。Fang等［53］研究发现，lncRNA细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码RNA(antisense non－coding RNA in the inhibitor of CDK4 locus，ANRIL)在DN小鼠系膜细胞中过表达，敲除ANRIL通过调节Wnt/β－catenin和分裂原活化抑制剂/胞外信号调节激酶途径抑制DN小鼠系膜细胞增殖、纤维化。Li等［54］发现，lncRNA浆细胞瘤多样异位基因1(plasma cytoma variant translocation gene 1，PVT1)在DN肾组织和高糖诱导的小鼠系膜细胞中高表达，沉默PVT1通过上调miR－93－5p阻断PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路抑制系膜细胞增殖、迁移侵袭和纤维化，促进细胞凋亡。Li等［55］研究表明，lncRNA钾电压门控通道亚家族Q成员1反向转录物1在高糖诱导的人系膜细胞中表达增加，而钾电压门控通道亚家族Q成员1反向转录物1敲除可通过调节miR－18b/高迁移率蛋白A2轴减轻系膜细胞增殖、氧化应激和ECM积累。以上研究表明，参与DN系膜细胞增殖和纤维化的lncRNA表达上调，且沉默其表达或基因敲除可抑制DN进展。

另有研究发现，lncRNA核富集转录体1在DN系膜细胞中高表达可靶向miR－27b－3p、多克隆抗体ZEB1及Akt/mTOR信号通路促进EMT过程，而下调其表达可抑制系膜细胞增殖、纤维化和炎症，促进细胞凋亡［56－58］。Zhang等［59］研究认为，lncRNA－p21高表达可促进体外培养的小鼠系膜细胞增殖及ECM积累，且能通过靶向miR－18b发挥促纤维化作用。此外，lncRNA MEG3在高糖条件下过表达可靶向miR－145诱导系膜细胞增殖、纤维化和凋亡［60］，又可通过miR－181a/Egr－1/Toll样受体4轴促进系膜细胞纤维化和氧化应激［10］，证实同样的lncRNA通过不同通路参与疾病进展的可能性，为DN发病机制和潜在治疗靶点提供了新见解。除参与系膜细胞增殖外，尚有研究表明lncRNA ARAP1－AS2在高糖诱导的HK－2细胞中表达显著上调，且通过表皮生长因子受体/TGF－β/Smad3信号调节HK－2细胞增殖和纤维化，促进高糖诱导的近端小管细胞损伤［61］，证实异常表达的lncRNA在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞损伤中均起重要作用。

LncRNA除在高糖条件下表达上调参与细胞增殖和纤维化进程外，另有研究表明lncRNA 1700020I14Rik在系膜细胞中表达减少，其过表达通过激活miR－34a－5p/沉默信息调节因子1/缺氧诱导因子－1通路抑制系膜细胞增殖和纤维化［62］。LncRNA CYP4B1－PS1－001在DN早期显著下调，刺激其表达可通过E3泛素连接酶Trim2调节重组人核仁蛋白泛素化和降解而抑制系膜细胞增殖和纤维化［63］。在糖尿病大鼠系膜细胞中，lncRNA牛磺酸上调基因1(taurine upregulated gene 1，TUG1)表达下调，过表达TUG1一方面通过抑制PI3K/Akt通路减少系膜细胞增殖和ECM积累减轻肾脏纤维化，另一方面通过拮抗miR－377对其靶基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ的下调作用，抑制高糖条件下ECM积累［64－65］起到肾保护作用。LncRNA GAS5在DN患者中表达明显减少且与DN相关并发症的严重程度呈负相关，其过表达通过靶向miR－221上调沉默信息调节因子1的表达，抑制系膜细胞增殖和纤维化［66］。综上可知，lncRNA异常表达在转录和转录后水平调节基因表达，通过不同的通路靶向下游分子蛋白诱导参与细胞增殖和纤维化，为DN发病提供新的可能机制，亦可作为疾病预后的生物标志物和治疗靶点。

2.5 参与DN细胞凋亡及自噬过程 自噬和凋亡是细胞的基本过程，对维持正常组织稳态至关重要。足细胞凋亡及自噬功能障碍可导致足细胞丢失及大量蛋白尿产生，被认为是DN进展的关键因素［67－68］。已有研究表明，lncRNA MEG3在糖尿病小鼠中表达减少，其过表达可抑制Wnt/β－catenin通路减轻足细胞损伤［69］，而MALAT1敲除亦可通过与β－catenin相互作用参与上述过程［16］。此外，Bai等［70］证实lncRNA 01619下调可介导miR－27a/叉头框转录因子O1轴诱导的DN足细胞损伤和内质网应激。Yang等［12］研究发现，lncRNA LINK－A在DN患者和无并发症的糖尿病患者中均下调，其高表达可激活缺氧诱导因子－1α而抑制小鼠足细胞凋亡。Liu等［71］发现，lncRNA PVT1在DN患者足细胞中高表达并抑制叉头框转录因子O1，从而诱导足细胞损伤和凋亡。Feng等［2］证实，lncRNA Gm5524敲除和lncRNA Gm15645过表达通过调节Bcl－2/Bcl－2相关X蛋白和微管相关蛋白轻链3/自噬相关蛋白通路诱导DN小鼠足细胞凋亡。Yang等［72］发现，lncRNA癌易感性候选基因2在高糖处理的小鼠足细胞及DN患者血清中表达显著降低，其过表达可能通过抑制c－Jun氨基端激酶减轻足细胞凋亡改善DN。Fan等［73］认为，lncRNA 4930556M19Rik在高糖刺激的足细胞中水平降低，其过表达通过下调miR－27a－3p、上调基质金属蛋白酶3逆转足细胞凋亡、纤维化和炎症发生。

另有研究表明，在高糖处理的小鼠足细胞中lncRNA TUG1表达下调并通过介导内质网应激－C/EBP同源蛋白－过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1α信号通路促进足细胞凋亡，而中药提取物黄芪甲苷可通过上调TUG1抑制肿瘤坏死因子受体相关因子5的水平减轻足细胞损伤［74－75］。作为近年来的研究热点之一，自噬已被证实广泛参与DN足细胞损伤的进程。其中，lncRNA SOX2重叠转录本在DN小鼠和高糖诱导的人足细胞中显著下调，其过表达通过miR－9/沉默信息调节因子1诱导足细胞自噬，减轻肾脏损伤［76］。而lncRNA精子相关抗原5在高糖处理的人足细胞中表达上调，其沉默可介导Akt/mTOR信号通路逆转足细胞凋亡和自噬障碍，减轻足细胞损伤［13］。总之，足细胞作为人体终末分化的细胞，不具有再生能力，大多数lncRNA通过靶向各通路及其下游分子蛋白调控足细胞损伤的过程，进而干预DN进展，目前已成为研究热点。

LncRNA异常表达除参与足细胞凋亡和自噬外，在肾小管上皮细胞及系膜细胞的凋亡过程中亦发挥重要作用。研究表明，高糖可显著上调lncRNA ANRIL的表达并抑制miR－let－7a，从而激活TGF－β1/Smad信号通路诱导人系膜细胞凋亡［77］。而lncRNA尿路上皮癌相关基因1在高糖诱导的HK－2细胞中表达明显减少，其过表达通过靶向miR－206抑制DN肾小管上皮细胞凋亡，可作为DN的潜在治疗靶点［78］。

2.6 其他可能的机制 除通过以上机制参与DN外，lncRNA对内质网应激、线粒体功能及肾小球内皮细胞损伤、细胞焦亡等也有调控作用。研究表明，DN患者lncRNA TCF7表达上调且通过与miR－200c结合促进内质网应激加速疾病进展［79］。MALAT1可诱导甲基转移酶G9a下游组蛋白H3第9位赖氨酸组蛋白甲基化并抑制Klotho蛋白表达，从而介导高糖诱导的肾小球内皮细胞损伤［80］。TUG1在DN小鼠足细胞中表达下调，其过表达刺激过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子α转录增强，进而增加线粒体含量和细胞ATP水平，使足细胞活性增加［81］。核富集转录体1在DN大鼠系膜细胞中显著增加能靶向miR－34c增强炎症小体的激活及胱天蛋白酶1依赖性细胞焦亡，并减少小鼠巨噬细胞的炎症反应［82］。但目前参与这些机制的lncRNA尚不多见，相关研究仍处于探索阶段，需反复证实并不断揭示更多可能参与的lncRNA，从而为进一步防治DN提供可靠依据。

3 小 结

DN是严重的代谢紊乱过程，一旦发展至终末期肾脏病，往往较其他肾脏疾病更难治疗。随着糖尿病发病率逐年上升，预计到2045年中国糖尿病患者将达到1.19亿，由此引发的DN将成为重大公共卫生问题［83］。虽然目前在新药、先进治疗策略、个体化护理等方面已取得了许多进展，但DN仍是世界范围内肾衰竭的主要原因，也是糖尿病患者死亡率最高的并发症之一［84］。近年来，许多研究发现lncRNA异常表达在DN发生发展中起重要作用，并在多个环节调控疾病进程［28，37，44，47，71］。在以往研究中，lncRNA通过分子间相互作用、介导信号通路和靶向miRNA表达影响DN进展，这些分子靶点的研究为疾病治疗和预防提供了重要思路。然而，由于收集人体肾活检标本困难，目前对lncRNA的研究多局限于小鼠或大鼠，且样本量较小，今后需进行大样本量的研究进一步验证。此外，很多研究主要报道其中一种lncRNA表达异常的影响，未发现更多有关联lncRNA相互作用对疾病的意义，未来需深入研究。