蛋白质组学在唐氏综合征产前筛查中的应用

赵晟隆，张为远

(首都医科大学附属北京妇产医院围产医学部，北京100026)

唐氏综合征是活产儿中最常见的非整倍体常染色体疾病，由第21号染色体的三倍体引起，表型累及身体多个系统，尤其是骨骼、肌肉和心血管系统，患者通常有身材矮小、肌张力低下、寰枢椎不稳定、神经元密度降低、脑发育不全、智力障碍和先天性心脏病(尤其是房室间隔缺损)等。唐氏综合征患者还易并发甲状腺功能减退、自身免疫性疾病、阻塞性睡眠呼吸暂停、癫痫、听力和视力障碍、血液系统疾病(包括白血病)、复发感染、焦虑症和早发性阿尔茨海默病等疾病［1－2］。全球唐氏综合征患病率为7∶5 000;新生儿唐氏综合征发病率为1∶1 000［3］;中国新生儿唐氏综合征发病率为1∶800［4］。目前，唐氏综合征的表型症状难以治愈，导致患病个体及其家庭的生活质量受到严重影响。因此，明确的产前筛查结果是诊断胎儿唐氏综合征的重要线索。现对母血、羊水、胎盘和脐血中的蛋白质组学研究及其在唐氏综合征产前筛查中的应用予以综述。

1 蛋白质组学简介

染色体异常导致基因表达量和质的差异，基因通过其所表达的蛋白质发挥对生命体的调控功能，蛋白质变化是生命功能失常的直接因素，随着研究的不断深入，蛋白质组学应运而生［5］。蛋白质组学为“一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质”，已被作为研究胎儿状况和妊娠相关疾病的平台，如胎儿非整倍体、早产、子痫前期、宫内感染和胎儿窘迫［6］。目前，需要通过一种更安全、更快速的替代有创羊膜腔穿刺术的非侵入性方法，并利用其获得的生物样本材料［如母体各种体液样本(如血浆、血清、尿液、宫颈黏液、阴道分泌物、唾液和羊水)和胎儿样本(如胎盘滋养细胞、胎膜和脐血)］寻找妊娠相关病理标志物［7］。

2 蛋白质组学的方法和技术

根据标本的性质进行样品分离、制备和破碎，且肽和蛋白质水平的分离步骤可能有所不同。鉴定蛋白质组学所使用的标记策略和总体方法汇总见表1。

表1 蛋白质组学技术及其功能

2.1 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳是利用蛋白质的等电点和分子质量两项独立的物理化学参数来分离复杂的蛋白质混合物。等电聚焦是通过电流通过时形成电压梯度的电解质溶液来实现［8］。在电场的作用下，蛋白质根据电荷迁移到pH值与蛋白质等电点相匹配的电解质区域。蛋白质在第一个维度被电荷分离，而在第二个维度则根据它们的质量不同而被分离，分子量分离是基于电场作用下蛋白质迁移速率的差异，通过聚丙烯酰胺凝胶中的电泳来实现的［6］。

2.2 质谱法 质谱是研究蛋白质混合物最有效的方法之一，适用于特定研究任务的高通量色谱－质谱分析策略在蛋白质形式研究方法中占据核心地位。根据研究目的将基于质谱的蛋白质组学方法分为适合筛选研究的鸟枪法以及用于分析特定蛋白质形式的靶向性方法［9］。在典型的蛋白质组学研究中，在质谱前行色谱分离，其允许在一个由两个接触的非混合相组成的系统中分离多肽，其中一个相通常相对于另一个相是流动的，即固定相移动［10］。

2.3 酶联免疫吸附试验(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA) ELISA是一种基于蛋白质畸变定位的方法，被用来鉴定病理生理条件。通过固定在固体表面的抗原与添加酶偶联抗体之间的相互作用来测量酶活性的波动，酶活性的波动与样品中的抗原抗体浓度成正比。ELISA基于固定的蛋白质(抗体)功能活性以及高度特异性的抗体－酶复合物相互作用两个原则［11］。

3 蛋白质组学技术筛选唐氏综合征标志物

胎儿发育异常反映在完整细胞、核酸(DNA和信使RNA)、多肽、蛋白质和酶等方面，它们在孕期保持着动态平衡，以维持正常的生理功能;胎儿发育异常会破坏这种固有平衡，引起蛋白质表达水平的改变［12］。既往有学者尝试利用基因组学探索新的负责表达生理变异的基因，但由于人类蛋白质组研究的复杂性，研究进展并不令人满意［13］。近年蛋白质组学技术才被用于妊娠研究，如通过识别正常胎儿和异常胎儿蛋白质的差异可能揭示特定疾病的发生途径，以加深对胎儿发育的认识和了解［14］。

3.1 母血特异性蛋白的筛选 早在2007年，Nagalla等［15］采用多种互补的蛋白质组学方法(包括荧光二维凝胶电泳、二维液相色谱－色谱聚焦、多维蛋白质鉴定技术和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱多肽图谱)对56例唐氏综合征筛查阳性孕妇［包括20例妊娠早期(孕11～13周)、36例妊娠中期(孕15～18周)］和56名正常妊娠女性的血清样本进行分析发现，妊娠早期和中期的母体血清学样本中分别有28种和26种蛋白的表达水平存在差异，其中孕早期19种、孕中期16种，孕早期和孕中期共有的蛋白10种。

基于质谱计数的多维蛋白质鉴定技术数据定量分析的蛋白有α1－酸性糖蛋白、血清淀粉样蛋白A、内α－胰蛋白酶抑制剂重链H4、血管紧张素原、载脂蛋白C－Ⅰ、纤维蛋白、血小板碱性蛋白、甲状腺素运载蛋白、载脂蛋白D和妊娠特异性糖蛋白。理论上，蛋白质组学可以识别单一、高度选择性的疾病生物标志物。然而，经目前反复研究证实，单个分子与特定疾病表型关联的确定不足以详细评估病理或有效预测疾病结果。相反，虽然覆盖疾病复杂性的生物标志物(横切面或纵切面)组合对个体间的变化不敏感，但更适合描述或代表疾病情况［16］。蒋滢等［17］对7份确诊唐氏综合征胎儿的孕中期(14～20周)母体血清和同期7份正常胎儿母体血清行二维凝胶电泳显示，唐氏综合征组母体血清中表达差异1.5倍以上的蛋白质点29个，其中19个表达上调、10个表达下调;且经质谱分析有12个蛋白质与差异表达2倍以上的8个蛋白质点匹配，该组蛋白可能与载脂肪蛋白类、丝氨酸蛋白酶类、β2糖蛋白类、激肽原类和补体C3类等有关;经蛋白质印迹验证发现，脱氧鸟苷三磷酸酶和β2糖蛋白1在唐氏综合征胎儿孕中期母体血清中高表达。

由于双向凝胶电泳的局限性，现代蛋白质组学研究大多采用电子喷雾质谱进行蛋白质组学分析，并主要依靠同位素标记相对和绝对定量技术进行定量分析，现已证明该系统非常有效［18］。López Uriarte等［3］采用纳米升级超高效液相色谱－质谱联用技术分析不同组别(10例未妊娠、10例正常妊娠、9例唐氏综合征妊娠)女性血清标本蛋白水平的差异发现，未妊娠女性血清标本中有10种蛋白质，正常妊娠女性血清标本中有8种蛋白质，而唐氏综合征胎儿孕妇血清标本有42种蛋白质(包括C4b结合蛋白α链、间α－解密蛋白抑制剂重链H1、血液结合素、载脂蛋白E、激肽原1，亚型CRA－b、β2糖蛋白1、α1－酸性糖蛋白、补体因子H等);妊娠两组女性血清中均含有大量的蛋白质，其中35种蛋白质一致。

基因调控是了解疾病机制的关键，因此利用同位素标记相对和绝对定量技术进行蛋白质定量有助于同时鉴定和定量蛋白质［19］。Zhao等［20］使用同位素标记相对和绝对定量技术对10名未妊娠女性、10名正常妊娠女性和10例唐氏综合征胎儿妊娠母体血清蛋白水平的变化进行定量分析发现，唐氏综合征胎儿组和正常胎儿组的11种蛋白质血清水平比较差异有统计学意义，其中6种蛋白质水平上调、5种蛋白质水平下调，4种蛋白质(妊娠特异性β1糖蛋白、组织蛋白酶D、血清淀粉样蛋白A2和血清淀粉样蛋白A)可能与唐氏综合征相关。

3.2 羊水标志物的筛选 自20世纪50年代以来，羊水细胞被广泛应用于胎儿畸形的产前诊断。妊娠中期的羊水细胞数量为10～1 000个/μL，其通过产生的多种因子(细胞因子、脂质和前列腺素等)应答来自自分泌、旁分泌和内分泌的信号［21］。由于上述内分泌因子均在羊水中产生，羊水中含有大量根据基因型构成和母胎调节而表达的蛋白质，此类蛋白质包括酶、结构蛋白、热激蛋白和信号转导蛋白等，其构成的平衡是孕期胎儿健康发育所必需的，而蛋白质构成的不平衡可导致妊娠并发症的发生，这为疾病研究提供了新的视角［22－23］。

目前唐氏综合征主要通过测定甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素和二聚体抑制素A水平进行筛查，通常在妊娠15周左右进行，假阴性率为22%～25%［24］。微阵列可在细胞水平上发现信使RNA表达的变化，但并不能提供关于细胞蛋白质组的全面信息［25］。因此，需要更有效的直接测量蛋白质表达的方法，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术目前仍是测量蛋白质表达的最有力工具［26－28］。但也有其他技术(如强阳离子交换)用于唐氏综合征的蛋白质检测和分析［29］。Liu等［30］对妊娠18～22周产前诊断高危唐氏综合征者行羊膜穿刺术检测羊水细胞中的蛋白质水平，结果显示，唐氏综合征羊水细胞18例，染色体正常羊水细胞20例;并采用双向凝胶电泳和电子喷雾质谱进行蛋白质组学分析发现了41个差异蛋白，在唐氏综合征羊水细胞中有6种蛋白质(钙黏蛋白、核磷蛋白、延伸因子－1β、组织蛋白酶D、血小板活化因子乙酰水解酶IB亚基β和14－3－3蛋白β/α)表达水平显著上调。免疫印迹法证实，核磷蛋白和组织蛋白酶D在唐氏综合征羊水中高表达;此外，基因剂量效应是导致唐氏综合征表型不同的原因之一，由于基因数量较大，很难清楚地了解位于第21号染色体上的基因与唐氏综合征表型之间的联系［31］。这些蛋白质都不是由第21号染色体上的基因编码，唐氏综合征由减数分裂不分离(约占95%)和体细胞有丝分裂错误(约占5%)所致［32］。

3.3 脐血特异性蛋白质筛选 脐血由全血中的所有元素(红细胞、白细胞、血浆和血小板)组成。通常认为，最接近疾病原发部位标本(脐血和胎盘细胞、组织和体液)中的潜在生物标志物水平最高，故通过脐血检测可诊断多种妊娠期胎儿疾病。文锦丽等［33］应用同位素标记相对和绝对蛋白定量法筛选出506种唐氏综合征胎儿脐血差异表达蛋白质，其中24中蛋白质的表达水平比较差异有统计学意义，16种蛋白质表达水平上调，8种蛋白质表达水平下调，以基质蛋白－3、胸腺肽β10和骨桥蛋白变化最明显。

脐血取材相对困难，但可直接反映胎儿蛋白表达的差异。Sui等［34］采用同位素标记相对和绝对定量技术与基因本体论分析研究6例唐氏综合征孕妇和11名健康孕妇脐血蛋白水平的变化，结果显示，与唐氏综合征相关的蛋白质有19种，其中13种表达上调、6种表达下调，结合相关研究结论明确载脂蛋白E、补体因子B、淀粉样蛋白P成分、Matrin－3和骨桥蛋白5种蛋白质与唐氏综合征相关，且前3种蛋白质在唐氏综合征中显著上调。

3.4 尿液标志物的筛选 尿液和尿多肽是潜在疾病生物标志物的重要来源。目前可检测到的尿液蛋白质和多肽数量超过10万，且仍在增多［35］。在健康人中，70%的尿多肽/蛋白来自肾脏和尿路，其余30%的尿多肽/蛋白由肾小球血液超滤产生［36］，因此，尿液不仅能反映泌尿生殖系统的信息，还可能反映远处器官的信息。Iles等［37］运用电子喷雾质谱技术发现，唐氏综合征组尿液在11 000～12 000质谱扫描范围(m/z)存在一个额外质谱峰，而6 000～8 000 m/z的质谱强度降低。根据上述特点，可辨别妊娠12～14周8例唐氏综合征样本与39例正常样本，但其对妊娠15～17周时唐氏综合征样本的辨别力较差，仅辨别出10个唐氏综合征样本中的7个。可见，应用尿液样本筛查唐氏综合征的检出率较高，假阳性率较低。Shan等［38］用弱阳离子交换磁珠对23例唐氏综合征孕妇和30名核型正常孕妇的尿液进行电子喷雾质谱分析，两组6种多肽的水平发生了显著变化，其质谱扫描范围分别为1 022.1、1 032.1、1 099.5、1 155.9、1 306.6和2 365.6 m/z;以上述候选多肽为基础，建立唐氏综合征与对照组分类模型的灵敏度为95.7%，特异度为70.0%，受试者工作特征曲线下面积为0.909(95%CI 0.835～0.984)。1 099.5 m/z和1 155.9 m/z的多肽峰分别为α1抗胰蛋白酶和热激蛋白β1的部分序列，为胎儿唐氏综合征产前筛查无创性生物标志物的发现和开发提供了可能的方向。

3.5 胎盘特异性蛋白质的筛选 胎盘是妊娠期间多种蛋白质和细胞因子变化的来源，对于胎盘组织蛋白质表达情况的研究既基础又直观，并可避免母体外周血细胞对研究结果的干扰。闫丽宇等［39］采用二维荧光差异凝胶电泳技术在10例唐氏综合征孕妇胎盘组织中发现352个差异表达蛋白质点，其中有统计学意义的蛋白质点为56个，对其三维丰度比值在1.5倍以上的17个差异蛋白质点行质谱鉴定，其中12个蛋白质点上调，5个蛋白质点下调;最终确定10种蛋白质可匹配，其中差异表达最明显的4种蛋白质为铜锌超氧化物歧化酶1、热激蛋白27、内质网分子伴侣29、过氧化物酶6。

4 小 结

基于质谱和生物信息学技术，蛋白质组学研究已经成为发现生物标志物的有力平台。新的生物标志物的发现有助于疾病诊断，并有望用于唐氏综合征产前筛查和诊断。目前，蛋白质组学方法仍存在局限性，其所发现的候选标记的性能在不同研究或实验室不能重现，且验证候选标志物有效性的进一步研究有限。未来仍需要通过建立生物样本处理的标准化程序、利用定量蛋白质组学技术提高重复性、结合生物信息学分析选择最佳的生物标志物、扩大临床验证研究并加强多中心合作等方式对蛋白质组学的应用进行深入研究。