夫精人工授精精液优化处理后孵育时间与临床结局的关系探讨

钟 诚

（惠州市中心人民医院生殖医学中心 广东 惠州 516001）

夫精人工授精（AIH）是指通过非性交方式将丈夫精液优化处理，去除精浆，使精子优化获能后，注入女性生殖道内，从而使精卵自然受精达到妊娠的目的。与体外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）等辅助生殖技术相比，人工授精因其授精方式更接近自然受孕，故具有操作简便、手术创伤少、治疗费用低廉、患者并发症少等优点，容易被患者所接受。人工授精临床妊娠率受女方年龄、男方精液质量等因素影响较大，其中男方因素中，精液优化处理后前向运动精子总数是影响临床妊娠率的主要因素[1]。本文拟探讨精液优化处理后的孵育时间是否与临床妊娠率存在相关性，从而为临床实践提供指导。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月—10月在我院生殖医学中心行夫精人工授精的不孕不育患者，共200例。记录男方精液优化处理结束后至行宫腔内人工授精手术间的时间，即精液孵育时间，孵育时间为0～30 min分为A组100例，孵育时间为31～60 min分为B组100例。患者及家属均知情同意并签署知情同意书。纳入标准：（1）女方年龄≤35岁，时段内的首个人工授精周期；（2）女方至少有一侧输卵管通畅，存在优势卵泡；（3）男女双方均符合夫精人工授精的适应证[2]；（4）男方精液优化处理方法为密度梯度离心法。排除标准：（1）男方精液优化处理后前向运动精子（PR）百分率＜90%；（2）男方精液优化处理后前向运动精子总数＜5×106；（3）男女任一方患有严重精神疾病、泌尿生殖系统急性感染；（4）男女任一方具有吸毒等不良嗜好。

1.2 方法

1.2.1精液优化处理 男方禁欲2～7 d，于人工授精日当天手淫取精，留取全部精液于无菌取精杯。待精液完全液化后，采用密度梯度离心法对精液进行优化处理。用SpermRinse洗精液将SpermGrad梯度液稀释成90%和45%两种浓度梯度液，火焰消毒巴氏吸管，15 mL锥形离心管底部加入1.5 mL 90%梯度液，再在其上部缓慢加入1.5 mL 45%梯度液。最后在45%梯度液的表层再缓慢加入2～4 mL液化后的精液。如患者精液量大于4 mL，则分置于2管含梯度液的离心管中。500 g离心20 min，去除精浆和梯度液，将底部沉淀加入另一支装有2 mL洗精液的离心管内，混匀，500 g离心5 min。弃上清，将沉淀重悬于0.5 mL洗精液中，同时取5μL样本，计数精子浓度、总活力及前向运动精子总数。

1.2.2人工授精方法 患者术前排空膀胱，取膀胱截石位，用生理盐水清洗外阴、阴道，拭净宫颈分泌物。窥器暴露宫颈，将优化处理后的0.5 mL精子悬液用人工授精导管通过宫颈缓慢注入宫腔内。术后14 d测血β-HCG阳性为生化妊娠，5～6周B超见孕囊确定临床妊娠。

1.3 观察指标

（1）女方年龄：分别记录每例女性患者行人工授精术时的年龄；（2）前向运动精子总数：精液优化处理后，取5μL样本，运用西班牙SCA全自动精子质量分析仪，按照世界卫生组织（WHO）第五版《人类精液检查与处理实验室手册》标准行精液常规分析，计数精子浓度、前向运动精子百分率等指标，计算前向运动精子总数。前向运动精子总数=精子浓度（106/mL）×优化处理后精子悬液量（mL）×前向运动精子百分率（%）；（3）临床妊娠率：依据血β-HCG及B超结果确定临床妊娠例数，计算A、B两组的临床妊娠率。临床妊娠率=临床妊娠例数/人工授精总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用（± s）表示，组间比较采用t检验，计数资料用频数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 两组女方年龄、精液优化处理后前向运动精子总数比较

两组女方年龄、精液优化处理后前向运动精子总数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组女方年龄、精液优化处理后前向运动精子总数比较（ ± s）

表1 两组女方年龄、精液优化处理后前向运动精子总数比较（ ± s）

组别 例数 女方年龄/岁前向运动精子总数/×106 A组 100 30.71±4.60 14.11±5.97 B组 100 29.93±3.42 15.54±5.51 t 0.732 0.455 P 0.467 0.650

2.2 两组临床妊娠率比较

A组临床妊娠率22.00%，高于B组的10.00%，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组临床妊娠率的比较

3.讨论

近年来，受生活工作压力增大、环境改变、婚育年龄推迟等因素的影响，不孕不育发病率呈逐年上升的趋势。有调查显示，在我国育龄夫妇中，发病率已高达25%[3]。人工授精适用于男方轻度少弱精、精液液化异常、性功能障碍、女方宫颈因素异常、生殖道畸形、免疫性不育、原因不明不育等的助孕治疗。虽然人工授精具有操作简单、费用低、并发症少、易于被患者接受等优点，但是与IVF、ICSI等助孕方式相比，临床妊娠率较低。受患者不孕原因等因素的影响，不同的生殖中心治疗周期临床妊娠率差异较大，为5.9%～23%[4]。既往有关夫精人工授精临床妊娠率影响因素的研究，多侧重于临床相关因素的研究，多提示治疗周期数、优势卵泡数、女方年龄、不孕年限、促排卵方案、子宫内膜厚度等是重要的影响因素[5-7]。

目前，实验室常用的人工授精精液优化处理方法有上游法和密度梯度离心法。上游法适用于精子浓度及活力等参数较好的精液标本，利用前向运动精子向上游动，从而达到与死精子、畸形精子及白细胞分层分离的目的。密度梯度离心法利用不同成熟阶段精细胞密度不同的特点，通过在梯度液中离心，达到分离成熟精子的目的。与上游法相比，密度梯度离心法具有更高的精子回收率，也能更好地分离前向运动精子与精浆杂质等成分。与此同时，相比上游法，密度梯度离心法由于经历长时间离心的过程，可能会对精子造成潜在的损伤，如精子膜的破坏、顶体不完整，同时死精子比例增高[8]。本文中，两组精液标本均采用密度梯度离心法对精液标本进行优化处理，两组精液优化处理后前向运动精子总数差异无统计学意义，临床妊娠率差异有统计学意义，提示精液优化处理后孵育时间过长，可能会对精液参数造成负面影响，从而影响临床结局。既往研究均提示精液优化处理后至行人工授精术时间间隔过长，会对精液参数及临床结局产生负面影响[9-13]。精液优化处理的离心过程对精子损伤造成的负面影响，可能会随着处理后孵育时间的延长而加剧。精液优化处理后孵育时间过长，精液中氧自由基含量增加，氧自由基通过损伤精子细胞膜、减低线粒体ATP产生从而减低精子运动能力。同时，孵育时间过长，精子DNA碎片率也会相应增高，从而对精子的受精能力产生影响。

综上所述，夫精人工授精精液优化处理后孵育时间控制在30 min以内，能改善临床结局。基于本样本量少的局限性，期待多中心更大样本量，得出更为确切的结论，以便为实际临床工作提供指导。