透明与否对离心沉降式宫颈液基薄层细胞制片质量的影响

刘 丹，刘盛均，陈 杨

（绵阳市中心医院病理科 四川 绵阳 621000）

宫颈癌是我国女性生殖系最常见的恶性肿瘤疾病，严重危害女性身体健康，宫颈细胞学筛查在预防子宫颈癌方面发挥着重要作用，液基薄层细胞学（TCT）检查作为宫颈细胞学筛查的首选办法，能有效对宫颈癌进行早期筛查，因此制备一张合格的涂片对最后的诊断至关重要，本文将针对透明与否对染色质量的影响进行探讨。

1.资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2020年4月—9月妇科及体检科送检的宫颈细胞学标本500例。

1.2 方法

1.2.1仪器及试剂 厦门迈威生物液基细胞检查系统，MCT-2000液基薄层细胞制片机、旋涡振荡器、制片器。液基细胞保存瓶、细胞提取液、细胞固定液（95%乙醇）、巴氏染液、苏木素、0.5%盐酸酒精、无水乙醇、环保透明剂、中性树胶、一次性吸管、盖玻片。

1.2.2液基薄层细胞学涂片的制备 每例标本均同时制备两张涂片分别标记A和B。具体操作如下：取回的细胞标本按患者姓名、编号进行登记，并在载玻片一端标记患者编号；将采集有细胞标本的保存液瓶放在振荡器上混匀5 min左右，注意拧紧瓶盖防止液体溢出造成污染；往制片器的沉降管中加入细胞提取液至刻度线（约3.5 mL）使过滤杯的底部滤网浸入提取液中；将细胞保存液轻轻倾倒入沉降管中，保持细胞提取液与细胞保存液分层清晰，细胞保存液的加入需注意以下三方面：（1）保存液加入的量视细胞多少而定，若保存液非常清亮细胞少则可多加一点或者先将保存液离心，去上清吸取底部沉淀物加入到沉降管中，若保存液浑浊细胞多则可少加一点。加入的细胞量要适中，加入的细胞量过少容易产生涂片不均，出现空白区域不见细胞的现象，而细胞量过多易造成涂片厚薄不均，细胞重叠漂浮等现象，细胞过多过少均不便镜检。（2）若送检标本含血液过多，可在细胞保存液中加入适量专用细胞清洗液，或者1 mL冰醋酸（保存液与冰醋酸之比为9:1）摇匀[1]，去除过多红细胞以免影响镜检。（3）若标本含黏液过多，可先采用酶消化处理[2]；将沉降管中的过滤杯轻轻提起丢弃，不破坏细胞提取液与细胞保存液的分层；将制片器对称放入MCT-2000液基薄层细胞制片机的吊篮中，相对位置底托摆放的方向一致，若不对称摆放会导致离心制片机内制片器中的载玻片被毁坏的严重后果；开启制片机800 r/min，2 min；取出制片器，倾去制片器中的上清液，向制片器沉降管内加入95%乙醇1～2 mL摇晃数次后倾去上清液，再加入95%乙醇1～2 mL固定30 s～2 min；取出载玻片进行巴氏染色。

1.2.3巴氏染色步骤 A、B两组涂片同时染色，首先将两组涂片于95%乙醇中固定10 min[3]；苏木素中染色5 min，根据染液使用的时间长短或染片数量或环境温度，适当增加或减少染色时间；自来水中漂洗，洗去多余苏木素；0.5%盐酸酒精中分化1～4 s，分化时间视分化液脱色力而定；流水反蓝，自来水中流水冲洗不少于3 min；95%乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各1 min; EA50染色液中染色1～3 min, EA50染液更换时间以苏木素染液的细胞核染色效果为准，需要更换时全套染液同时更换；梯度酒精脱水，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ缸各30 s，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸各1 min。

1.2.4透明 A组涂片脱水干净后放入环保透明剂中两缸各透明5 min，取出涂片中性树胶湿封片；B组涂片脱水干净后直接从酒精中取出空气中自然干片，中性树胶干封片。

2.结果

A组酒精脱水后透明中性树胶湿封片的涂片染色鲜艳，不同类型细胞显色分明，核浆对比清晰，细胞核、核仁、核膜结构清晰，诊断信息明确（如图1）。B组酒精脱水后直接空气中自然干燥中性树胶干封片的涂片出现胞膜分界欠清，胞质难以辨识，部分胞核浓染，染色质颗粒及核仁等细节无法观察的现象（如图2）。将A、B组涂片染色效果从色彩、细胞形状及胞膜、核形状及核细微结构三方面进行对比，见表1。

图1 细胞轮廓感强，胞膜清晰锐利，胞质明显

图2 胞膜分界欠清，核浆对比模糊，染色质颗粒欠清晰

表1 液基细胞涂片染色后透明与否结果比较

3.讨论

透明剂是一类能与乙醇、石蜡、中性树胶互溶的有机溶剂，如二甲苯、甲苯、氯仿等有毒试剂及Histoclear、Van-clear、TO型生物制片透明剂（简称TO试剂）等环保透明剂，用于石蜡组织制片中，作为脱水、浸蜡过程的中介溶剂和封片时的透明剂及中性树胶溶剂，以提高组织、细胞折光率。本实验证明离心沉降式宫颈液基薄层细胞制片使用透明剂透明并湿封片，可显著改善制片质量，未经透明可导致染色质量下降，出现背景污秽，透明度欠佳，部分胞核染色略加深，部分胞膜分界欠清，胞质欠明显，核浆对比模糊，染色质颗粒欠清晰，核细微结构难以辨别等现象，严重影响诊断。

我科现有的透明剂有二甲苯，TO试剂，环保透明剂。其中二甲苯价格便宜、透明效果好、作用时间短被广泛采用，但二甲苯是一种具有芳香气味的挥发性液体，长期接触可造成免疫功能低下，吸入二甲苯蒸汽可刺激眼、鼻、喉，高浓度时可致严重呼吸困难，甚至死亡，在生活中也多处渗透性侵入[4]，是公认的有毒的化学品之一。TO试剂是一种以优质松节油为主要原料并采用特殊配方合成的无色芳香透明液体，无毒，是一种安全、环保的新型试剂，能与乙醇互溶，能溶解石蜡、树胶等，其效果与二甲苯无显著差异。环保透明剂主要成分为液体石蜡，为无色无味的透明液体，不含苯，是一种环保的二甲苯替代物，环保透明剂具有低挥发性且对组织渗透较二甲苯柔和，即使透明时间长也不易造成组织的干涩、脆硬等现象，利于切片平整、完美，不会出现镜下空洞与厚薄不均的现象[5]，也正是这种特性，使用环保透明剂透明细胞染色涂片时需适当延长时间。三种透明剂各有优劣，综合考虑，我科选用环保透明剂作为常规透明剂使用，效果理想无毒无害环保，深受病理工作者的喜爱，见表2。

表2 二甲苯、TO试剂、环保透明剂优劣比较

目前正是新型冠状病毒肺炎疫情期间，全球疫情仍在蔓延，且有可能较长时期存在，在液基细胞涂片制备过程中会直接接触到患者的血液、体液感染性物质，暴露风险中等[6]。做好病理医务工作者的防护工作，是预防和减少感染的关键举措，更是维护其身体健康和生命安全的必然要求，操作人员在操作过程中应注意生物安全防护。根据《新冠肺炎疫情期间医疗机构不同区域工作岗位个人防护专家共识》中指出病理科工作人员处理一般患者标本防护标准为一级防护：（1）严格遵守标准预防的原则。（2）工作时穿工作服，戴工作帽和医用外科口罩，戴乳胶手。（3）严格遵守消毒的各项规章制度，空气消毒，首选自然通风，保证室内外空气的流通，室内无人时使用紫外线灯照射消毒，每次消毒时间不少于1 h，每天2～4次；物体表面及地面的消毒，实验前后1000 mg·L-1含氯消毒剂擦拭物体表面（操作台、仪器、电脑）或拖地，每天至少2次，遇标本漏洒污染时，先去除污染再使用含有效氯2000 mg·L-1的含氯消毒剂消毒，作用30 min，注意消毒剂要现用现配，24 h内使用；生物安全柜消毒使用75%酒精，因含氯消毒剂有腐蚀作用一般不建议使用，消毒后清水清洁消毒，结束后开启紫外杀菌灯消毒[7]。（4）严格执行手卫生，七步洗手法洗手，戴手套。

近年来宫颈癌发生率有上升趋势，应引起高度重视，该病属于可预防性疾病，但因其病理发展过程较长，早期临床症状不具有典型性，早期诊断难度较高。因此，能够通过早期筛查及时明确高危人群，从而及时给予合理规范的治疗，以改善患者预后降低宫颈癌死亡率至关重要。

液基细胞学检查方法具有操作方便、快速、无创、灵敏度高、准确性高等优势[8]，作为国内普遍使用的宫颈癌前病变筛查工具。稳定的制片质量是保证其诊断准确的基础，因此要求病理工作者掌握好离心沉降式宫颈液基薄层细胞制片染色技术，染色结束后透明湿封片制备出一张优秀的细胞涂片。优秀的液基薄层细胞涂片可提高诊断医师阅片速率及临床诊断准确性，起到早发现早诊断早治疗的作用，降低宫颈癌的发病率。