187份玉米自交系抗旱性评价及SSR标记关联分析

钟 源,赵小强

(甘肃农业大学甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃 兰州 730070)

玉米(ZeamaysL.)是全球最为重要的粮食、饲料及经济能源作物之一，其生产安全对保障国家粮食增产、促进畜牧业发展及改善人民生活质量有重要作用。干旱是最为重要的非生物逆境胁迫之一，其严重影响玉米的正常生长发育，使玉米的生理生化代谢紊乱，并最终导致玉米籽粒品质下降和严重减产[1-3]。国内外相关研究表明[1,4-6]，干旱胁迫下玉米的株高、穗位高、穗位比、散粉-吐丝时间间隔(anthesis-silking interval, ASI)、雄穗分枝数及雌穗个数等农艺性状比产量(grain yield, GY)具有更高的遗传力，这些农艺性状与玉米的抗旱性紧密相关，更适合作为玉米抗旱性鉴定的参考指标。目前CIMMITY (Centro Internacional de Mejoramientode Maizy Trigo)[7]和新疆农业科学院[8]等单位已选用上述抗旱相关农艺性状在田间筛选出了一系列玉米优良抗旱种质资源。此外，玉米的抗旱性是由少数主基因加多个微效基因或修饰基因共同调控，同时还显著受环境及基因型与环境互作的影响，呈典型的数量性状遗传特征[9-11]。借助分子标记技术挖掘玉米这些抗旱相关农艺性状的功能基因/数量性状位点 (quantitative trait locus, QTL)或紧密连锁的分子标记是进行玉米抗旱分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)育种的基础，是遗传改良提高玉米抗旱性能的重要途径。

近年来诸多学者已在多种水旱环境下对玉米的株高、穗位高、穗位比、ASI、雄穗分枝数及雌穗个数进行了QTL定位。Zhao等[1]采用CIM (composite interval mapping)法以Langhuang×TS141和Chang7-2×TS141构建了2套F2∶3群体在8种水旱环境下定位到了10个穗位比QTL，其主要位于玉米的第1、2、4、5、6、8和9号染色体上。吴建伟等[12]以A188×91黄15构建了1套F2∶3群体在水分胁迫环境下检测到了10个QTL与株高和穗位高相关，并在8号染色体上检测到了1个同时调控株高和穗位高的主效QTL。赵小强等[13]以TS141为共同父本，廊黄和昌7-2分别为母本开发了2套F2群体，在玉米的株高、穗位高、穗位比、ASI及雄穗分枝数等性状间分别检测到了11、10、9、9和8个QTL，其中株高和穗位比均受基因的加性、部分显性及显性遗传效应控制，穗位高受基因的部分显性、显性及超显性遗传效应控制，ASI受基因的显性和超显性遗传效应控制，雄穗分枝数受基因的加性、部分显性及超显性遗传效应控制。甚至，Zhao等[4]通过整合51种不同水旱环境下19套玉米F2、F2∶3、F3、RIL (recombinant inbred lines)及BC1S1(backcross-self cross population)群体中调控雄穗分枝数和雌穗个数的QTL信息，采用meta-QTL (mQTL)分析检测到了20个mQTL，并挖掘到了34个调控玉米花序发育的候选基因。从这些研究不难看出，由于不同学者所采用试验群体的遗传背景、大小、类型、检测环境及QTL定位方法不同，导致所检测到的与这些抗旱相关的农艺性状的QTL信息不仅在QTL数量与遗传效应方面，而且在对环境的稳定性方面均存在较大差异，其反映出了玉米这些性状遗传基础的复杂性，如若获得广泛认可的结论尚需更深入的研究。

关联分析也称为连锁不平衡作图，它是利用分子标记对供试群体候选基因进行检测或扫描，进而获得丰富的基因位点及其等位基因信息，并在大量群体材料中鉴定出与目标性状间存在正向贡献的优异等位基因的方法[14]。目前，Ducrocq等[15]在玉米、张娜等[16]在小麦(TriticumaestivumL.)、董俊杰等[17]在水稻(OryzasativaL.)及Sun等[18]在大麦(HordeumvulgareL.)等作物利用此方法对重要性状基因进行挖掘。本研究拟在不同水旱环境处理下田间鉴定187份供试玉米自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数ASI及雌穗分枝数的变化，综合评价其抗旱性强弱；采用SSR (simple sequence repeats)标记技术和GLM (general linear model)关联分析寻找不同水旱环境下与玉米这些性状紧密连锁的SSR标记，以期为玉米抗旱MAS育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以甘肃省干旱生境作物学重点实验室收集及自育的187份玉米自交系为试材。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米农艺性状田间鉴定 于2017年4月中旬至9月下旬在甘肃省农业科学院黄羊镇麦类作物育种试验站(37.97°N, 102.63°E; 海拔1 508 m)进行试验。玉米生育期4—9月试验地的气象数据见图1。试验参照Zhao等[5]和赵小强等[19]方法均设正常供水 (CK)及干旱胁迫处理(S)，其中CK处理为玉米全生育期内只要降水不足时就及时供水，而S处理在玉米大喇叭口前期至花期结束不供水，其他生育时期每隔20 d供水1次。每一处理均采用完全随机区组设计，3次重复，相应供试材料为单行区，行长5 m，株距25 cm，行距40 cm。播前统一整地、施肥并采用平膜覆盖试验地，其他管理同一般大田。花后第10 d每一处理相应供试自交系中选择长势整体一致的植株10株，参照Zhao等[4]及赵小强等[13]方法测定其株高(PH)、穗位高(EH)、雄穗分枝数(TBN)、ASI和雌穗个数(EN)，并计算穗位比(EHPH)，即：

EHPH=EH/PH

(1)

干旱胁迫环境下单个性状的变化率(RC)[9]按以下公式计算， 即：

RC=(1-Ts/Tw)×100%

(2)

式中，Ts和Tw分别为干旱胁迫和正常供水环境下相应性状的测定值。相应性状的抗旱系数(DRC)[1]按以下公式计算，即：

DRC=Ts/Tw

(3)

以每一性状的DRC作为抗旱性评价指标，利用

模糊隶属函数法对抗旱性综合评价，即：

Uij=(DRCij-DRCjmin)/(DRCjmax-DRCjmin)

(4)

或Uij=1-(DRCij-DRCjmin)/(DRCjmax-DRCjmin)

(5)

式中，Uij为第i个材料第j个指标的抗旱性隶属值，DRCij为第i个材料第j个指标的抗旱系数，DRCjmax为所有材料中第j个指标抗旱系数的最大值，DRCjmin为所有材料中第j个指标抗旱系数的最小值。若所测性状与自交系的抗旱性正相关，用(4)式计算隶属值，反之则用(5)式。累加各指标的隶属值并计算均值后进行比较，均值越大则自交系的抗旱性越强。采用统计软件IBM SPSS 19.0对不同水分处理下的所有性状进行描述性统计分析、联合方差分析及Pearson相关分析。参照Knapp等[21]的方法估算相应性状的广义遗传力(H2)，即

H2=VG/(VG+VGE/n+Ve/nr)×100%

(6)

式中，VG为基因型方差，VGE为基因型与环境互作方差，Ve为误差，n为环境个数，取值2，r为重复数，取值10。

1.2.2 SSR标记关联分析 参照赵小强[20]方法提取187份供试自交系幼苗的全基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50 ng·μL-1，-20℃低温保存备试验所需。从MaizeGDB (Maize Genome Database)数据库网站(http://www.maizegdb.org/)中选取均匀分布于玉米10个连锁群且多态性较好的SSR标记145个，参照赵小强[20]方法进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。采用Structure 2.3.1 (http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)软件进行群体遗传结构分析，估计最佳群体组群数K(K设为1～10)，将MCMC (markov chain monte carlo)开始的不作数迭代参数定为10 000次，再将不作数迭代后的burn-in period设为100 000次，number of iterations设为8，计算Q参数，将其作为协变量。采用Tassel 2.1 (https://sourceforge.net/projects/tassel/files/latest/download)软件的GLM进行关联分析。GLM分析中，以不同玉米自交系的对应Q值作为协变量，将SSR标记与不同水旱处理下的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数、ASI及雌穗个数间进行回归分析，检测与其相关联的标记，并计算解释率。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对玉米自交系6个农艺性状的影响

187份玉米自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数、ASI及雌穗个数均在基因型间差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)，不同处理下其变异系数介于7.31%～62.16%(表1和图2)。说明不同玉米自交系的这6个农艺性状间差异显著，其在这些农艺性状方面存在丰富的遗传变异。187份玉米自交系的6个农艺性状在水分环境间也在P<0.05或P<0.01水平达到了差异显著，干旱胁迫下187份玉米自交系除ASI显著增大外，其余5个性状均明显降低，且干旱胁迫下这些自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数及雌穗个数分别下降了4.68%、4.63%、10.87%、11.96%、11.91%，而其ASI升高了72.73%(表1和图2)。表明玉米的这6个农艺性状明显受水分环境的影响，其可作为玉米抗旱性评价的重要参考指标。187份玉米自交系的这6个性状还在基因型与水分环境互作间差异显著或极显著。说明玉米这6个农艺性状的大小还明显受其本身的遗传基因型与水分环境互作的影响。此外，不同水分环境下187份玉米自交系的这6个农艺性状的偏度和峰度基本介于-1.0～1.0之间，呈典型的数量遗传特性，且这些性状的广义遗传力均较大，介于60.57%～86.03%(表1和图2)。

表1 不同水旱环境下供试玉米自交系的6个农艺性状的表型鉴定

2.2 玉米自交系6个农艺性状间的相关性分析

由表2可知，187份玉米自交系的株高与穗位高、ASI、雌穗个数均在P<0.01或P<0.05水平下显著正相关，与穗位比、雄穗分枝数间极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)负相关；穗位高与穗位比、ASI、雌穗个数间呈极显著或显著正相关，与雄穗分枝数间呈显著负相关；穗位比与雄穗分枝数、ASI及雌穗个数间均表现为显著正相关；雄穗分枝数与ASI间极显著负相关，与雌穗个数间显著正相关；ASI与雌穗个数间极显著正相关。说明玉米的这6个农艺性状间彼此相互关联，其相互作用共同构成不同玉米自交系间的差异。

表2 供试玉米自交系6个农艺性状间的相关分析

2.3 玉米自交系群体的遗传结构分析

利用Structure 2.3.1软件对供试玉米自交系进行群体遗传结构和模型聚类分析。结果表明，当K=1～10时，ΔK在K=5时出现明显峰值(图3)，因此可以判定187份玉米自交系可划分为5大类群。5大类群的遗传固定指数大于0.05。说明这5大类群均能独立成群。对照代表性自交系可知，这5大类群分别为LRC(红色)、TSPT(绿色)、Lan(粉色)、P(黄色)及Reid (蓝色)类群等(图3)。

2.4 玉米自交系抗旱性综合评价

进一步采用187份玉米自交系株高、穗位高、穗位比、ASI、雄穗分枝数及雌穗个数等6个农艺性状的抗旱系数作为不同玉米自交系抗旱性强弱评价指标，并采用隶属函数法综合评价这些供试玉米自交系的抗旱性强弱。结果表明，根据隶属值的大小将187份玉米自交系划分为强抗旱自交系(隶属值>0.66)、中等抗旱自交系(隶属值介于0.34～0.65)及旱敏感自交系(隶属值<0.34)，其分别为45、74和68份(表3)。

表3 供试玉米自交系抗旱性综合评价

2.5 不同水旱环境下玉米6个农艺性状与SSR标记的关联分析

采用一般线性模型(GLM)对145个SSR标记位点与不同水旱环境下玉米的6个农艺性状进行了关联分析。结果表明，总共检测到了13个SSR标记与不同水旱环境下玉米的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数、ASI及雌穗个数在P<0.01水平显著关联，表型变异的贡献率介于2.15%～17.13%，其主要位于第1、2、3、4、5、7、8及9号染色体上(表4)。除umc2025 (Bin 1.05)、nc133 (Bin 2.05)及umc1378 (Bin 7.00)与雌穗分枝数、mmc0041 (Bin 1.08)和umc2363 (Bin 2.02)与ASI、umc1662 (Bin 4.05)和umc1194 (Bin 8.02)与穗位高相关联外，其余6个SSR标记与3～5个农艺性状间同时相关(表4)。

表4 不同水旱环境下与玉米6个农艺性状的SSR标记及其对表型变异的解释率 (P<0.01)

3 讨论与结论

本研究对不同水旱环境下187份玉米自交系的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数、ASI及雌穗个数等进行了比较分析发现，两种水旱环境下所有供试玉米自交系的这6个农艺性状间差异较大，其变异系数介于7.31%～62.16%。说明本研究供试玉米自交系在这6个农艺性状间存在丰富的遗传变异。本研究还表明，干旱胁迫环境下这些玉米自交系的ASI显著增大，而其余5个性状均显著减小，干旱胁迫后这些性状的变化程度依次为ASI (-72.73%)>雄穗分枝数(11.96%)>雌穗个数(11.91%)>穗位比(10.87%)>株高(4.68%)>穗位高(4.63%)，且这些性状在不同水旱环境下的广义遗传力均高于60%。这与Zhao等[5]、Cai等[22]、Dong等[23]及Nikolic等[24]的研究相一致，表明干旱缺水会严重影响玉米植株的正常生长及生殖器官的发育并最终导致玉米严重减产，因此玉米的株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数、ASI及雌穗个数等可作为玉米抗旱性鉴定的重要参考指标，并可依据这些指标对玉米的抗旱性进行综合评价。基于以上考虑，本研究还利用这6个农艺性状进一步计算了其抗旱系数作为相应材料的抗旱性评价指标，借助隶属函数法对本研究187份自交系的抗旱性进行了综合评价，并在抗旱隶属值在大于0.66时筛选出强抗旱自交系45份，这为玉米抗旱新品种培育提供了优良的种质材料。

关联分析是利用分子标记位点或基因间的LD关系来解析分子标记与目标群体表型性状间的相关性，并最终鉴定出与表型变异紧密相关的基因位点[14]，因此利用此方法可对玉米有关重要数量遗传性状进行有效QTL定位。本研究采用GLM模型对两种水旱环境下187份玉米自交系的6个农艺性状进行了关联分析，在株高(5个)、穗位高(6个)、穗位比(3个)、雄穗分枝数(4个)、ASI (5个)及雌穗个数(4个)间共检测到了13个相关SSR位点，其主要位于第1、2、3、4、5、7、8及9号染色体上，且单个相关SSR位点的表型贡献率为2.15%～17.13%。在这些找到的相关SSR位点中，大约85.19%的相关SSR位点可在干旱胁迫环境下被检测到。因此，干旱环境下检测到的与玉米这6个农艺性状相关联的SSR位点为今后玉米抗旱分子遗传机理的解析及抗旱MAS育种奠定基础。此外，Tuberosa等[25]认为由于不同性状间存在共同的遗传机制，因此“一因多效”或是控制不同性状的基因普遍呈紧密连锁的现象，同样我们在本研究中也检测到了6个SSR标记(bnlg149、phi053、umc1621a、umc1155、umc1072及umc1120)同时与多个玉米农艺性状相关，且这与本研究中6个农艺性状间的Pearson相关分析的结果高度一致，即单个农艺性状与其余2～5个性状间呈显著或极显著正/负相关。说明玉米染色体的这些SSR位点是共同调控玉米6个农艺性状的重要区域，其附近可能存在一些重要调控基因。

其中，位于Bin 1.01处的bnlg149同时与两种水旱环境下的穗位高、雌穗个数、正常供水环境下的株高及干旱环境下的穗位比间同时连锁，解释的表型变异为2.41%～9.07%。玉米的bnlg149-umc1292区间，Zhao等[5]采用mQTL分析在多种水旱环境下检测到了1个同时调控株高、穗位高及穗长的mQTL1-1，并在该mQTL区间内预测到了SYP121 (syntaxin of plants 121)、MYB31及SPIRAL1等候选基因，且Eisenach等[26]研究指出SYP121调控拟南芥(Arabidopsis)细胞膜上K+通道的转运及气孔的开闭。Agarwal等[27]研究表明MYB31是参与玉米抗旱性应答的重要转录因子之一。Wang等[28]报道SPIRAL1在拟南芥耐盐等抗逆性方面扮演重要角色。phi053 (Bin 3.05)位点处同时与两种水旱环境下的株高、穗位高、穗位比、ASI及正常供水环境下的雌穗个数间同时相关，表型贡献率为2.15%～6.22%。Guo等[29]以5003×P138构建了1套RILs群体，并采用CIM法在phi053位点附近检测到了多个干旱胁迫环境下的株高QTL，解释的表型变异为1.68%～1.97%，还找到了1个QTL位点与正常供水环境下的ASI相关，其表型贡献率为3.02%。吴建伟等[30]利用A188×91黄15发展了1套F2∶3群体，还在Bin 3.04附近的phi265454位点处检测到了1个主效QTL调控了两年正常供水处理下的玉米株高，其表型贡献率分别为7.3%和27.0%，且受基因的部分显性及显性遗传效应的调控。刘忠祥等[31]发展了1套高代回交重组自交系在玉米的Bin 3.04～3.05/ Bin 3.05～3.06处的bnlg602-SSR5/SSR4-umc2266识别到了1个调控玉米株高的主效QTL，并进一步精细定位将该主效QTL定位到了C42-P17之间的20 Mb内，且该主效QTL是GA (gibberellin)途径之外的新基因。umc1621a (Bin 4.06)位点处同时与两种水旱环境下的雄穗分枝数和雌穗个数及干旱胁迫环境下的ASI间紧密连锁，解释的表型变异为3.62%～4.02%。Zhao等[4]以Langhuang×TS141构建了1套F2:3群体同样在bnlg1621a-umc2027区间检测到了1个与多种水旱环境调控玉米雌穗个数的QTL，能够解释4.73%～19.96%的表型变异，且受基因的加性和部分显性遗传效应调控。甚至，Zhao等[4]进一步通过整合51种水旱环境下构建的19套定位群体也在Bin 4.06处的bnlg1621a-bnlg1784区间的9.2 Mb内检测到了1个同时调控玉米雄穗分枝数和雌穗个数的mQTL4-2，并在该mQTL区间挖掘到了ZAG3和LOXs等候选基因。Wu等[32]研究发现ZAG3是一种MADS-box基因，其调控玉米花序分生组织和籽粒脂肪原基的发育。Roychowdury等[33]报道水稻中抑制LOXs基因表达可显著提高其稻米的品质。标记umc1072 (Bin 5.07)同时与2种水旱环境下的株高、雄穗分枝数及ASI间显著关联，其解释了2.68%～15.79%的表型变异。Wei等[34]以Zong3×Xu178开展了1套SSSLs (single segment substitution lines)群体在Bin 5.06～5.08的umc1680-bnlg118区间检测到了1个调控玉米株高的主效QTL，其受基因超显性遗传效应的调控。表明Bin1.01、Bin 3.05、Bin 4.06及Bin 5.07等附近是调控玉米株高、穗位高、穗位比、雄穗分枝数、ASI及雌穗个数的重要“一因多效”或富集位点，且这些区域存在一些重要调控基因，为不同水分环境下玉米这些农艺性状的生长发育发挥重要的积极效应。另外，本研究还检测到了2个新的SSR位点与不同供水环境下的玉米农艺性状显著关联，分别是位于位点umc1155 (Bin 5.05)处同时与正常供水环境下的株高和穗位高相关联，可解释4.11%～13.25%的表型贡献，及位于umc1120(Bin 9.04)位点同时与2种水旱环境下的株高、穗位高及穗位比间显著连锁，解释的表型变异为3.10%～4.73%，这2个显著连锁的SSR可为不同水旱环境下调控玉米植株生长发育的QTL/基因挖掘提供新信息。