87份糯玉米自交系的遗传多样性分析

陈志坚

(福建农业职业技术学院， 福州 350000；福建省特色旱作物品种选育工程技术研究中心， 福州 350013)

玉米进入中国后，在西南地区种植的普通饲料玉米发生自然突变后经人工选择而获得糯质类型玉米，即糯玉米。学名ZeamaysL. sinensis Kulesh 即有“中国种”之意，糯玉米可作杂粮食用，具有一定的营养价值，可降低血液胆固醇浓度并防止其沉积于血管壁，能有效改善日常膳食结构等，市场对品质优、营养价值高的糯玉米新品种要求越来越高[1]。但是目前糯育种玉米总产和品质徘徊不前，根本原因是种质遗传基础狭窄和种质资源匮乏，迫切需要拓宽和创造新的种质资源[2]。因此，为了适应市场的需求，选育更多优质高产稳产糯玉米新品种，就需要利用现代生物技术对糯玉米种质资源进行深入的研究，从分子水平了解他们的亲缘关系，为新品种选育提供参考。玉米是杂种优势研究的代表性作物，新品种的选育最重要的是选择的玉米自交系配合力高，组配后有杂种优势，如果对现有的玉米自交系的亲缘和血缘关系在分子水平上有科学的认识，那将极大提高玉米自交系的改良及新品种的选育效率，但是自“杂种优势”概念的提出并运用于玉米育种实践后，随着玉米杂交种的推广，玉米种质资源的匮乏且遗传基础狭窄已经成为玉米育种界的共识[3-6]。研究表明，RAPD，RFLP，SSR、SNP等分子标记技术提供的遗传多态性信息含量丰富，结合相应遗传分析软件，可以从分子水平上科学准确的掌握自交系间的亲缘关系和遗传多样性，玉米具有良好的杂种优势，利用这个优势进行育种是选育玉米新品种的重要手段，详细了解亲本之间的亲缘关系和杂种优势，从而更好地利用已有的各种优异种质资源，选育出更高产、更优质的新品种[7-10]。前人通过SSR和SNP标记技术对玉米遗传多样性进行过研究，SSR和SNP分子标记方法的划群结果均与系谱来源基本一致，且适用于糯玉米自交系的遗传多样性分析，同时结合自交系的田间表型性状划，一般配合力和特殊配合力的数据，可以很大程度上提高育种效率[11-13]。本研究通过分子标记技术，从收集的糯玉米种质资源中选出87份农艺性状较好的骨干自交系，利用国家玉米DUS测试使用的40个SSR 核心标记进行遗传聚类分析。从分子水平对87份糯玉米种质资源的亲缘关系进行聚类分析，为构建育种群体提供亲缘关系参考，从而提高糯玉米杂种优势利用质量，加快优质高产稳产糯玉米和甜加糯玉米新品种选育效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为课题组近年收集的87份糯玉米自交系，含4个双隐自交系N 1、N 3、N 4、N 5，12个紫色糯玉米自交系N 3、N 4、N 15、N 17、N 24、N 31、N 42、N 47、N 48、N 57、N 79、N 81，3个黄糯自交系N 72、N 73、N 75，其余67份为普通白色糯玉米自交系(表1)。

表1 87份糯玉米自交系代号

利用玉米品种鉴定规程SSR标记法(NY/T 1432—2014)所用的40对SSR核心引物为标记[13](表2)。

1.2 试验方法

以87份自交系2叶1心新鲜叶片为材料，用叶片DNA提取法 CTAB方法提取叶片基因组DNA。PCR扩增总体积为10 μL，其中包括混合酶5 μL，上下游引物0.8 μL，DNA 2 μL，ddH2O 2.2 μL(混合酶和引物均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。采用基因公司MG 96 G型 PCR仪进行扩增，反应程为:94 ℃模板DNA预变性5 min后，94 ℃变性55 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸55 s，35个循环，最后72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。扩增产物在40%聚丙烯酰胺凝胶120 V电压下电泳90 min，银染显影。

根据 PCR 扩增图谱，在相同位置有条带标记1，没有条带标记0，缺失标记9，建立矩阵数据库。计算多态性含量 (PIC)，各自交系间的遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD)，分别由SPAGeDi、PowerMarker V 3.25 和 MEGA 5.1软件完成。

2 结果与分析

2.1 SSR多态性分析

用40对SSR标记对87份糯玉米自交系进行多态性试验。利用PowerMarker V 3.25软件分析，结果表明，40对核心引物SSR标记共检测到等位基因变异数89个，检测的每对引物等位基因变异平均为2.23个，变异的范围是1～4个，多态性信息含量PIC平均为0.32，等位基因频率平均为0.71。40个SSR标记的87份糯玉米自交系上PIC值平均为0.32，根据0.25

2.2 87份自交系基因型间的亲缘关系(Kinship)分析

利用SPAGeDi软件获得群体的亲缘关系矩阵，同时将矩阵中的负值设置为0，根据亲缘关系矩阵进行评估群体亲缘关系的分布。分析87份自交系的Kinship得出，99.2%的自交系Kinship系数在0～0.5之间，其中59.8%的自交系Kinship系数为0，说明59.8%的自交系间无亲缘关系；10.5%的自交系Kinship系数为0～0.1之间，说明这些自交系之间的亲缘关系较弱；29.7%的自交系Kinship系数为0.1～0.5之间，表明这些自交系亲缘关系较近；0.8%的自交系Kinship系数分布为0.5～1.2之间，说明这些自交系间的亲缘很近，无杂种优势。其中，ZN 18与YYH 06之间的Kinship系数最大，为1.17，C 6 F与Z 362之间Kinship系数次之，为1.16，说明这两对自交系的亲缘关系很近，无杂种优势，不适合组配杂交种。

图2 87份自交系的Kinship系数分布Fig.2 Kinship coefficient distribution of 87 inbred lines

2.3 87份自交系基因型的遗传聚类分析

利用PowerMarker V 3.25 软件分析87份糯玉米的基因分型数据，利用MEGA 5.1软件，计算87份糯玉米自交系之间的遗传距离，通过构建遗传图谱进行遗传聚类分析，87份糯玉米自交系间的遗传距离在0～0.63之间，平均为0.23；其中，自交系ZN 18与YYH 06之间遗传距离最小，与Kinship分析结果一致。将87个糯玉米自交系分为四个类群，以N 8为代表的69个自交系为Ⅰ群，N 37为代表的10个自交系为Ⅱ群，N 15为代表的5个自交系为Ⅲ群，N 65为代表的3个自交系为Ⅳ群。聚类将4个双隐的自交系N 1、N 3、N 4、N 5聚合在一起，同时，N 5与N 3和N 4的Kinship值为1.16和1.099 4，也表明他们之间有较近的亲缘关系。12个紫色糯玉米自交系在Ⅰ群，3个黄糯自交系N 72，N 73，N 75在Ⅰ群，他们的Kinship值接近0.5，互相组配杂种优势不强。

根据遗传分析划分四个群，根据自交系生长特点，结合Kinship值可明确自交系的利用方向，提高组配成功率。比如，N 1田间表现植株较矮，籽粒白，棒细长，配合力好，与N 1的Kinship值为0的自交系有47个，理论上可以从中组配出皮薄、脆、口感好的甜加糯新品种；黄色籽粒糯玉米自交系N 72，植株粗壮，果穗籽粒排列整齐色泽光亮，可以选择Kinship值为0或者较低的白色自交系进行组配，筛选黄白色泽对比度好品质优的双色甜加糯新品种。通过聚类和Kinship分析，将糯玉米自交系划分至不同的群中，明确自交系间的遗传距离和亲缘关系，提高育种效率。

表3 40对引物遗传分析信息

图3 87份糯玉米自交系遗传距离NJ聚类分析 Fig.3 Neighbor-joining cluster map of genetic distance of 87 waxy maize inbred lines

3 讨 论

采用分子标记技术研究玉米遗传信息，对改良玉米自交系和组配优质杂交组合有很高的参考价值。本研究采用40对SSR引物，在87份玉米自交系中检测到89个等位基因变异，平均每对引物检测出的等位基因变异为2.23个，变异范围为1～4。通过聚类分析与Kinship系数分析，利用SSR分子标记可以有效得出玉米自交系间的亲缘关系，可以将亲缘关系不清或血缘关系不明晰的玉米种质资源进行科学的划分，为科学划分玉米杂种优势群和杂交种的组配提供科学参考。

Kinship系数能清晰地反映87份自交系之间两两的遗传亲缘关系。N 4、N 5两个均为双隐改良亲本选的二环系的姊妹系，与Kinship值为1.10相吻合，两者组配无杂种优势，与实际组配情况一致。利用Ⅰ群中的N 13与Ⅲ群的N 2和N 15杂交，组配出两个杂种优势优良的组合闽糯133(闽审玉20180007)和花糯1101(赣审玉20170004)。N 13与N 2、N 15的Kinship相似系数分别为0和0.12，从分子水平也说明他们具有一定杂种优势。以此为指导，用N 13与Ⅲ群中的N 33、N 77、N 84组配，检验后代杂种优势是否与遗传分析结果相一致。

目前，选育的在参试或者已经通过的几个新品种，花糯1101由N 13与N 15组配而来，2017年通过江西省审定；闽糯133由N 13与N 2组配而来，2018年通过福建省审定；闽糯811由N 13与N 58组配而来，2018年通过福建省审定，审定编号为闽审玉20180006；这3个组合间的Kinship值均为0。

在甜加糯品种选育方面，N 3作为双隐亲本，植株中等，花粉量大，与其Kinship值为0的自交系达49个，目前组配的4个甜加糯玉米新组合闽花甜糯136，荟甜糯139，闽甜糯251和闽甜糯816正在参加南方国家糯玉米区试、国家东南科企联合体糯玉米区试和福建省糯玉米区试，其中闽花甜糯136以产量第一的优势通过国家东南区2018年糯玉米区试 ，进入2019年续试。说明N 3配合力高，可以继续与其他更多的Kinship值为0 的自交系进行组配，筛选出优质甜加糯新品种。

王兵伟等[14]和韩晴等[15]采用SSR分子标记技术对玉米自交系进行聚类，分析结果与已知系谱关系基本一致，说明SSR分子标记技术可靠，可用于玉米自交系遗传多样性分析。福建省糯玉米种质资源遗传基础比较狭窄，育种中突破较少，随着近些年的对外交流，在种质资源创制方面取得一些突破，今后在加强对现有的种质资源进行遗传多样性分析研究和利用的基础上，加大种质资源的创制、引进与改良工作，结合现代分子育种技术，通过掌握他们之间的亲缘关系，进行有目的性的创制，能够提高亲缘关系较近的自交系间的多态性位点和SSR位点的等位基因数，促进该类群自交系的利用，结合种质资源自身特性配合力高低等，为后续骨干自交系的选育和优质组合的组配提供科学的指导[16-18]。