不同泌乳期和地区母乳中表皮生长因子和唾液酸水平分析

2021-06-27周雄靳登鹏卜玲玲柯倩华刘焕柳春红

中国乳品工业 2021年5期

周雄，靳登鹏，卜玲玲，柯倩华，刘焕，柳春红

（1.华南农业大学食品学院；广东省食品质量安全重点实验室，广州 510642；2.农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（广州），广州 510642）

0 引言

母乳含有丰富的营养物质，是婴儿早期的主要营养来源，世界卫生组织建议在婴儿出生后的前六个月，婴儿唯一的营养来源应该是母乳，而母乳作为婴儿营养的主要来源应该继续持续一到两年[1-3]。唾液酸(sialic acid，SA)，是一族神经氨酸的氮或氧基取代的衍生物，是构成糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分[4]。母乳中唾液酸在婴儿的生长、发育、免疫、认知具有重要的作用。研究发现增加婴儿配方奶粉中唾液酸的含量可以提高0～6个月健康婴儿的认知发育能力[5]。一些研究证明了唾液酸确实对婴儿神经系统和大脑的发育有益，因此，在婴儿神经系统和大脑发育的关键期应多摄入唾液酸[6-8]。母乳中富含唾液酸修饰的人乳寡糖（Human milk oligosaccharides,HMOs），母乳喂养时，经唾液酸修饰的HMOs能在婴儿相应的免疫系统完全建立前帮助婴幼儿抑制寄生虫、细菌、病毒的生长繁殖，抵制病原体的入侵，有助于降低肠道疾病、呼吸道感染的发病率[9-11]。EGF是一种促细胞分裂剂，同时EGF能刺激许多细胞DNA合成和有丝分裂，其在母乳中刺激DNA合成的效果显著高于其在血清中效果[12]。EGF是一种刺激消化道细胞增值分化的一种重要生长因子，有助于消化道的发育与成熟[13]。母乳是提供婴幼儿肠道的EGF的来源。随着泌乳期的增加，EGF的含量逐渐下降[14]。研究人员重新评估羊水和人乳中EGF对婴儿小肠细胞（FHs）的作用，发现母乳中的EGF对肠黏膜的成熟和愈合至关重要[15]。EGF对低pH和消化酶具有抗性，所以其能够通过胃进入肠道，促进肠道营养物质的转运及蛋白质的合成。除此之外，EGF还可以通过抑制胃酸的分泌来保护胃黏膜[16]。Khailova L等[18]发现EGF有多种保护婴儿肠道的作用，包括抑制程序性细胞凋亡，纠正有促炎性TNF-诱导的肠和肝紧密连接蛋白的改变[18]。由此可见，SA和EFG对于保证婴儿早期的正常生长发育都至关重要。本研究通过分析不同泌乳期和地区母乳中SA和EGF的差异，以期能为婴儿EGF和唾液酸的合理补充及婴儿配方奶粉设计提供参考。

1 实验

1.1 样本的采集和处理

选择北京和苏州两座城市各7名产妇，收集健康产妇1、2、6月三个月的母乳，所有样本采集时均获知情同意。每名志愿者收集3 mL母乳分装冻存于冻存管中，置于-80℃冰箱中冻存。待检测时，样本置于4℃，待解冻完全后，样本在4℃，10 000 rpm/min，离心30 min，重复一次，吸取乳清部分作为待测样本。

1.2 材料与试剂

甲醇、乙腈均为色谱纯。三氯乙酸、三氟乙酸、硫酸、β-疏基乙醇、无水硫酸钠、硫代硫酸钠、冰乙酸均为分析纯，4-5-亚基二氧基-1,2-邻苯二胺盐酸盐为色谱级别。实验所用水均为一级水。

1.3 仪器与设备

美国Thermo Fisher公司多功能酶标仪，海尔公司-80℃超低温冰箱，德国Eppendorf公司超高速离心机，日本岛津LC-20A液相色谱(配有荧光检测器)。

1.4 母乳中EGF和SA的检测

1.4.1 EGF测定采用ELISA试剂盒，试剂盒为武汉云克隆公司产品

1.4.2 高效液相色谱法测母乳中唾液酸的含量[19]

母乳中唾液酸是以游离、与低聚糖结合的、与蛋白质结合的和以神经节苷脂的形式存在，但是以神经节苷脂的形式存在的唾液酸在母乳中所占比例(＜0.5%)，所以母乳中总唾液酸含量即为游离、与低聚糖结合和与蛋白结合的唾液酸含量之和。本研究先检测游离和与低聚糖结合的唾液酸，再检测与蛋白质结合的唾液酸，两者之和即为总唾液酸。

1.4.2.1 游离和与低聚糖结合唾液酸含量的测定

用移液枪移取100μL的乳汁溶液于无菌离心管中，加入400μL的超纯水，然后再加入500μL的10%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白，混匀后冰浴10 min，然后在3 000 rpm/min的条件下离心30 min,取出上清液至新的离心管中，向沉淀中加入500 uL冷的5%三氯乙酸洗涤，混匀后在4℃，3 000 r/min离心30 min，吸取上清液到第一次的上清中，即合并两次上清液。合并的上清液加入等体积的0.1 mol/L三氟乙酸，样品80℃水解30 min，取出后冷却至室温，精确吸取冷却至室温的溶液90 uL，加入10μL DMB衍生液，50℃避光衍生150 min,冷却后的溶液经过0.22μm的滤膜过滤，将过滤后的溶液进行液相色谱分析，此中的唾液酸为母乳中游离和与低聚糖结合的唾液酸之和。

1.4.2.2 与蛋白结合唾液酸含量的测定

于处理后的沉淀中加入2 mL(0.05 mol/L)硫酸，80℃水解120 min，取出后冷却至室温，精确吸取上述溶液90μL，加入10μL DMB衍生液50℃避光衍生150 min，冷却后的溶液经过0.22μm的滤膜过滤，过滤后的溶液按液相色谱条件分析。

1.4.2.3 总唾液酸含量

将上述检测的两种含量相加，即为总唾液酸含量。

1.4.2.4 色谱检测条件

色谱柱：C-18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)，配Security Guard TM保护柱；柱温30℃；检测器：荧光检测器，荧光检测器激发波长373 nm，发射波长448 nm；流动相为甲醇-乙腈-超纯水(7∶8∶85)；流速为0.9 mL/min；进样体积10μL。

1.5 统计学分析

实验数据使用Excel数据库录入，使用SPSSstatistics 20.0软件进行统计学分析，实验数据表示的形式为平均值±标准差（Means±SD），采用单因素方差分析进行多组间比较。进一步进行组间两两比较，若方差齐时，采用LSD检验；若方差不齐，采用Tamhane’s检验，差异显著水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01。

2 结果与讨论

2.1 基本情况

本研究共募集14名产妇，共收集1、2、6月母乳各14份，其中表1是产妇基本信息表。提供样本的志愿者年龄在21至40岁之间。北京地区志愿者的平均年龄在32岁左右，而苏州地区志愿者的平均年龄在26岁左右，略高于苏州地区志愿者的年龄。北京地区的志愿者的平均体重要略低于苏州地区。而两者的BMI指数在正常的指标内（18.5～24）。所有指标并无统计学差异（P＞0.05）。

表1 产妇基本信息统计表

2.2 EGF含量测定结果

不同泌乳期和地区因素对母乳中EGF含量的影响如图1所示，随着泌乳期的延长，EGF的含量呈现下降趋势，北京和苏州地区母乳中的EGF含量都是1月最高，分别达到1.73 ng/mL，1.70 ng/mL。在不同泌乳期的比较中，苏州地区6月和1月相比，有显著差异（P＜0.05）,其余泌乳期并未表现出显著性（P＞0.05）；同时在不同地区比较中，EGF含量差异不显著（P＞0.05）。

图1 不同泌乳期和地区对母乳中EGF的影响

母乳中的EGF对婴幼儿的生长发育至关重要。但是随着泌乳期的延长，母乳中的EGF含量会发生动态变化。在婴幼儿时期，婴儿的消化道发育并不成熟，需要摄入外源性的EGF促进消化道的成熟，随着婴幼儿的成长，消化道的发育逐渐完善，对外源性的EGF的需求逐渐降低，因此母乳中EGF含量也就出现逐渐下降。蒋嘉靖[20]研究发现母乳中的EGF随着泌乳期的延长，含量逐渐下降，其中第6周时候母乳中EGF含量为1.94 ng/mL。Power M L等[10]研究发现随着泌乳期的增加，EGF的含量逐渐下降，本研究发现随着泌乳期的延长，母乳中的EGF含量逐渐下降，结果与前人研究一致。本研究中，在不同地区因素对母乳中EGF和唾液酸的影响并未显示出统计学差异（P＞0.05）。因此，地区差异是否影响母乳中某些生物活性物质含量还需进一步探讨。

2.3 唾液酸含量的测定

2.3.1 游离和低聚糖结合唾液酸的测定结果

不同泌乳期和地区因素对母乳游离和低聚糖结合的唾液酸含量的影响如图2所示，随着泌乳期的延长，母乳中的游离和低聚糖结合唾液酸的含量呈现显著的下降趋势，1月母乳中游离的唾液酸含量最高，北京和苏州地区母乳中的含量分别达到467.85 mg/L，404.09 mg/L，在不同泌乳期的差异比较中，2月、6月的北京和苏州地区的游离的唾液酸含量与1月的相比有显著差异（P＜0.05），在不同地区的差异比较中，未发现显著性差异（P＞0.05）。

图2 不同泌乳期和地区对母乳中游离和低聚糖结合的唾液酸的影响

2.3.2 与蛋白质结合的唾液酸的测定结果

不同泌乳期和地区因素对母乳中与蛋白质结合的唾液酸含量的影响如图3所示，随着泌乳期的延长，母乳中的与蛋白质结合的唾液酸含量呈现显著的下降趋势，1月母乳中与蛋白质结合的唾液酸含量最高，北京和苏州地区母乳中的含量分别达到94.99 mg/L，108 mg/L，在不同泌乳期的差异比较中，2月、6月的北京和苏州地区的与蛋白质结合的唾液酸含量与1月的相比有显著差异（P＜0.05）；在不同地区的差异比较中，未发现显著性差异（P＞0.05）。

图3 不同泌乳期和地区对母乳中与蛋白质结合的唾液酸的影响

2.3.3 总唾液酸含量的测定

不同泌乳期和地区因素对母乳中总唾液酸含量的影响如图4所示，随着泌乳期的延长，母乳中的总唾液酸含量呈现显著的下降趋势，两个地区都是1月母乳中总唾液酸含量最高，北京和苏州地区母乳中的含量分别达到562.85 mg/L，512.46 mg/L，在不同泌乳期的差异比较中，2月、6月的北京和苏州地区的与蛋白质结合的唾液酸含量与1月的相比有显著差异（P＜0.05）；在不同地区的差异比较中，未发现显著性差异（P＞0.05）。

图4 不同泌乳期和地区对母乳中总唾液酸的影响

母乳中含有丰富的唾液酸，是婴儿早期摄入唾液酸的唯一来源，但是随着泌乳期的延长，母乳中唾液酸的含量逐渐下降。母乳中的唾液酸，在婴儿早期的成长具有重要作用，但是其自身的合成能力比较弱，需要摄入比较多的外源性SA，以满足自身的生长发育所需，随着婴儿月龄的增长，其自身合成唾液酸的能力加强，对外源性SA的需求逐渐降低，因此，母乳中SA的含量逐渐下降。乔阳[21]研究发现母乳中唾液酸的含量随着泌乳期的延长，母乳中各种形式的唾液酸含量逐渐降低，第30日母乳中的总唾液酸含量为714.3±64.4 mg/L，同时随着泌乳期的延长，含量逐渐下降。Claumarchirant L等[22]研究发现马德里地区1月的母乳含量为51.0±1.6 mg/100mL，同时随着泌乳期的延长，唾液酸含量逐渐下降，本研究与其报道结果一致。同时Claumarchirant L等[22]发现西班牙马德里产妇母乳中的唾液酸含量低于瓦伦西亚（P＜0.05）。这种地域差异可能与营养物质的有关，例如牛奶，鸡蛋和奶酪等富含维生素A的物质在瓦伦西亚的摄入比较多，而维生素A会增加Neu5Ac的合成[23]。