锡林郭勒牧区鲜马奶风味物质与微生物多样性分析

于佳琦，夏亚男，乔晓宏，双全

（1.内蒙古农业大学 食品科学与工程学院，呼和浩特 010018；2.阿巴嘎旗照富经贸有限责任公司，内蒙古 锡林郭勒盟 011400）

0 引 言

锡林郭勒地区是蒙古族文化主要发源地之一，马匹和酸马奶是其民族文化的重要组成部分[1]。鲜马奶中营养成分丰富，酪蛋白与乳清蛋白比例适合人体消化吸收[2]。鲜马奶在生产生活中，一方面被认为是最接近母乳的动物奶源，可作为过敏婴儿的安全替代食品[3]。另一方面，为酸马奶产品营造了微生物发酵环境，也为其风味物质合成提供前体物质。目前文献多是探究鲜马奶的营养指标和酸马奶的微生物多样性[4-5]，较少研究鲜马奶细菌和真菌多样性。本文采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)及高通量测序技术调查锡林郭勒地区鲜马奶主要风味物质及核心微生物群落组成，全面揭示鲜马奶的风味物质与微生物多样性，以期为酸马奶的风味调控及品质优化和安全保障提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

实验分析所用鲜马奶样本是于2019年6月采自内蒙古自治区锡林郭勒盟阿巴嘎旗牧区的3个平行样品（命名为XN_1,XN_2,XN_3）。在测定总酸度和pH值后分装于采样管，封口并于干冰中转移至实验室，冷冻保存用于后续试验。

乙醚，氯化钠，无水硫酸钠等，分析纯；3-辛醇（纯度≥98%），上海麦克林生化科技有限公司；E.Z.N.A.®soil DNA kit，美国Omega Bio-tek；琼脂糖，西班牙biowest；FastPfu Polymerase，中国TransGen；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，美国Axygen。

1.2 仪器与设备

FG2-ELK便携式pH计，METTLER TOLEDO；N-EVAP-45氮吹仪 美国Organomation；Thermo Trace 1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪；DB-Wax（30m×0.250mm×0.25μm）色谱柱；日立CF16RN冷冻离心机；MX-F固定式漩涡混匀仪，美国SCILOGEX；NanoDrop2000超微量分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific；DYY-6C电泳仪，北京市六一仪器厂；GeneAmp®9700型PCR仪，美国ABI；5424R高速台式冷冻离心机，美国Eppendorf；Miseq PE300测序仪，美国Illumina。

1.3 方法

1.3.1 鲜马奶pH值及总酸度测定

在采样现场通过便携式pH计测定pH值，滴定酸度参照GB5009.237—2016《食品pH值的测定》中酚酞指示剂法测定。

1.3.2 风味物质测定方法

（1）样品前处理。参照苏海荣的方法并稍作改进[6]，取鲜马奶样品10 g，加入200μL质量浓度为310 mg/L的3-辛醇内标物，加入氯化钠至过饱和（有利于香气物质的萃取）。取溶液于50 mL离心管中，4℃下分别用10 mL和5 mL的乙醚以转速为5 500 r/min离心5 min萃取2次，合并上层有机相。氮吹浓缩至约0.2 mL，再以乙醚复融定容至2.0 mL，无水Na2SO4干燥，0.22μm有机相膜过滤，供GC/MS上机分析。样品重复测定3次。

（2）GC-MS检测条件。色谱条件：参照洪家丽等方法[7]并稍作改进，进样口温度250℃；进样不分流，程序升温为40℃保持5 min，以3℃/min升温至200℃，保持5 min，再以2℃/min升温至230℃，保持10 min。载气为氦气，流速1.0 mL/min。

质谱条件：离子化方式：EI；电子能量70 eV;离子源温度230℃;质量扫描范围m/z40-500。

（3）定性定量分析。利用Xcalibur工作站NIST谱库自动检索各组分质谱数据,并结合保留指数进行定性分析。采用半定量的方法计算各风味化合物的相对含量，根据内标物质(3-辛醇)与各组分峰面积比值计算[8]。

1.3.3 样品总DNA提取

使用E.Z.N.A.®soil DNA kit试剂盒进行微生物群落总DNA抽提。提取成功后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，并使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。

1.4 PCR扩增及MiSeq高通量测序

细菌16SrRNA基因V3-V4可变区：上游引物：338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，下游引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。扩增程序：95℃预变性3 min，27个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s），然后72℃稳定延伸10 min，最后在4℃进行保存。

真菌ITS区PCR扩增：上游引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'），下游引物：ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。扩增程序：95℃预变性3 min，27个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸45 s），然后72℃稳定延伸10 min，最后在10℃进行保存。

PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4μL，浓度为2.5 mmol/L的d NTPs溶液2μL，上游引物（浓度为5μmol/L）0.8μL，下游引物（浓度为5μmol/L）0.8μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4μL，模板DNA 10 ng，补足至20μL。每个样本3个重复，将3个重复的PCR产物混合，之后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物[9]。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化PCR产物后用QuantusTMFluorometer进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。寄于上海美吉生物医药科技有限公司通过Illumina MiseqPE300平台进行高通量测序。

1.5 数据处理及生物信息学分析

使用Trimmomatic软件原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接，质控过滤测序质量低、错配率高和不能进行拼接的序列，得到优质序列进行分析处理。利用上海美吉公司提供的Sanger生物云信息平台对测序数据进行细菌多样性分析。

2 结果与分析

2.1 鲜马奶中酸度及风味物质分析

2.1.1 鲜马奶pH值及滴定酸度

该鲜马奶样品中pH值为6.64±0.35，滴定酸度为(14.50±2.94)°T。结果表明鲜马奶酸度是偏中性，这与前人的检测结果一致[10]。中性的环境和丰富的营养成分可以为微生物的生长供应更好的条件[11]。

2.1.2 鲜马奶风味物质分析

采用液液萃取与气质联用法（LLE-GC/MS）测定鲜马奶中风味化合物，总离子流如图1所示。

图1 鲜马奶风味物质总离子流

由图1可以看出，鲜马奶的风味物质分离效果较好。在鲜马奶中共检测到22种风味物质，包括12种酸类、4种芳香族化合物、3种酯类、2种酮类和1种醇,如表1所示。酸类物质是鲜马奶的主要风味物质，检测到的种类及质量分数（（31.15±0.59）μg/g）均最高，其中乙酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸和亚麻酸质量分数较高，为鲜马奶主要的酸类物质。据报道，乙酸具有醋酸味，口感刺激，酸而不涩。而辛酸和癸酸的质量分数越高，越能赋予乳制品更好的奶香品质，对奶香味的贡献越大[12]。可见酸类物质为酸马奶的刺激口感及奶香味做出了较大贡献。

表1 鲜马奶中的风味物质

大多数的酯类物质都具有水果和花香味，对于降低发酵乳中脂肪酸和胺的尖锐、苦涩的味道有帮助[13]。鲜马奶中总酯质量分数较低（0.26μg/g±0.15μg/g），且仅检测到14-甲基十五酸甲酯、（Z）-十六烷基十一烯酸甲酯和E-11-十六碳稀酸乙酯3种物质。4种芳香族化合物总质量分数为（5.39±0.11）μg/g，包含苯乙烯、1,3-二叔丁基苯、2,6-二叔丁基对甲酚和2,4-二叔丁基苯酚。酮类物质检测到2-十五酮和2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮两种。鲜马奶中仅发现十二硫醇一种醇类物质，质量分数为（5.45±0.06）μg/g。通常醇类物质风味阈值较高，因此对发酵乳的风味贡献度较小[14]。

现有的科学文献中，鲜有专门针对鲜马奶中风味物质的研究，较多的是探究酸马奶及其发酵期间风味物质的差异，且风味物质种类多在35～60种[12,15-16]。鲜马奶中营养成分丰富，大多作为风味物质的前体物质存在，相比于经过乳酸菌和酵母菌发酵的酸马奶，其酸类、醇类和酯类物质等种类少，很多大的挥发性分子是通过成熟的过程才能逐渐成为主导[17]。通过LLE-GC/MS法测定鲜马奶中醛酮类物质数量较其他学者研究结果更少，说明不同地区的样品以及不同的样品前处理方法都对试验结果有很大的影响。目前关于鲜马奶中风味物质的测定研究较少，该结果可以为探究鲜马奶风味提供一定的参考。

2.2 鲜马奶中微生物多样性分析

2.2.1 细菌和真菌序列的丰度和多样性

通过Illumina Miseq高通量测序从3个鲜马奶样本中共获得116,045条细菌和171,178条真菌高质量的优化序列，样本的平均读数分别为38,682（标准差=5,167）和57,059（标准差=5,009）。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平下的微生物操作分类单元OTU（Operational Taxonomic Units）进行划分，按最小样本序列数进行抽平，结果表明所有样本细菌序列归属于5个门，6个纲，10个目，13个科，20个属，28个种，30个OTU。所有样本真菌序列归属于5个门，17个纲，34个目，54个科，67个属，84个种，119个OTU。表2是关于样本信息及α多样性指数表。

表2 样本细菌和真菌信息及α多样性指数

α多样性是评价微生物群落丰富性和多样性的指标。Chao1指数和Ace指数用来估算测序样本中所含OTU个数，反映群落丰富度[18]。本试验中样本真菌的平均Chao1指数（56.33±20.60）和Ace指数（61.55±24.39）均显著高于细菌的Chao1指数（28.33±1.70）和Ace指数（28.86±2.42）。Simpson指数和Shannon指数表征群落多样性，结果显示真菌群落多样性（Simpson指数0.33±0.04；Shannon指数2.03±0.25）高于细菌群落的多样性（Simpson指数0.25±0.04；Shannon指数1.80±0.09）。以上α多样性指数表明该批次鲜马奶样本真菌物种丰富度和多样性较高，真菌群落组成较为复杂。将抽平后的细菌和真菌序列作稀释性曲线，如图2所示。

图2 样本的稀释性曲线（a,c）和香浓曲线（b,d）

由图2可以看出，稀释性曲线趋于平缓，且随着测序量的增大，实际观测到的物种数不断减小，表明测序量的合理性，但真菌稀释性曲线中第一组样本的实际观测到的物种高于其余两组，说明该组样本的重复性略差，可能与样品本身以及测序环境有关。细菌和真菌的香浓曲线达到饱和，结合表中样本的覆盖率均大于99.9%，表明该测序结果能充分解释鲜马奶样品的微生物群落信息，仅有很少一部分的微生物群落未被覆盖到。

2.2.2 鲜马奶细菌群落组成多形性分析

鲜马奶细菌门水平和属水平相对丰度如图3所示。

图3 鲜马奶细菌相对丰度Bar图

将每个OTU代表序列与Silva数据库进行比对，所有细菌序列归属于5个细菌门，包括厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、蓝菌门。鲜马奶的优势细菌门为变形菌门，平均相对丰度62.27%，其次为厚壁菌门，平均相对丰度35.46%，两个细菌门总计占整个酸马奶样本的97.73%，而其余未提及到的细菌门相对丰度较低，均在1%以下。

在属水平上共鉴定出了20个细菌属。平均相对丰度大于1%的属共有7个，包括肠杆菌属(Enterobacter)、劳特菌属(Raoultella)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和巨型球菌(Macrococcus)，总计占细菌群落的97.73%。鲜马奶的群落组成中肠杆菌属为优势菌属，相对丰度最高（44.83%），其次为劳特菌属（17.27%）。赵飞燕等也在鲜马奶中检测到了上述细菌，还有一部分芽孢杆菌和气单胞菌[19]。

鲜马奶作为一种原料乳，其微生物质量对于确保加工马乳制品的质量至关重要。据报道，原料乳中一般含有复杂的微生物群，这些微生物的质量与母畜的健康、奶头表面、饲料、草场环境、挤奶方式和运输条件等都息息相关[20]。原料乳基质中由于营养丰富及含水量高，为绝大多数的微生物提供了生长的便利条件[21]。鲜马奶中发现的细菌群落大部分属于乳酸菌（LAB），如乳球菌属、乳链球菌属、明串珠菌属、肠杆菌和肠球菌等。有文献报道，部分乳酸菌可以将乳制品底物中的可发酵糖类转化为乳酸、水解酪蛋白、分解脂肪以及进行柠檬酸发酵[22]。而乳酸菌发酵后的酶和代谢产物（如乳酸、芳香族化合物、乙偶姻、游离氨基酸、有机酸、胞外多糖等）在酸马奶的酸度、口感、香气和质地方面起重要的贡献[23]。

鲜马奶中的优势细菌属肠杆菌和肠球菌属于肠道微生物。有研究表明，它们在传统发酵食品的风味及感官品质中起着积极作用[24]，能表现出一定的益生菌活性且被应用于生产具有血管紧张素转化酶抑制活性的发酵乳[25]。但不可忽略的是肠球菌是一种机会病原体，因此，肠杆菌和肠球菌更多的被认为是鲜马奶中的污染细菌[26]。引起鲜马奶细菌污染的原因可能有：①病原微生物如乳链球菌、大肠杆菌等可能存在于母马乳腺；②农场卫生条件差，挤奶用具等存在污染；③传统的人工挤奶方式；④采集样本季节（包括温度和湿度）的变化；⑤低温冷藏促进嗜冷菌的生长并产生耐热酶，在贮藏过程中水解乳蛋白和脂肪，导致原料乳变性保质期缩短等[27]。

鲜马奶中的细菌污染可能会导致产品的质地，颜色和风味变差，从而缩短使用寿命，也可能对消费者的健康状况有所影响，产生严重的疾病。因此建议在单独食用前对其进行加热处理，尽可能杀灭部分腐败微生物，提高产品的安全性。在马乳制品的加工方面，尽量避免鲜马奶直接自发发酵，建议添加微生物种类质量更优质的引子进行发酵。发酵营造的低pH值环境、乳酸菌竞争性保护作用以及酸马奶特有微生物产生的抑菌物质等使有害微生物存活率下降，提升发酵马奶制品品质。

2.2.3 鲜马奶中真菌群落组成多形性分析

鲜马奶真菌门水平和属水平相对丰度如图4所示。

图4 鲜马奶真菌相对丰度Bar图

真菌也是鲜马奶中非常重要的一类微生物区系。通过ITS序列，所有真菌被鉴定为主要的两个门：子囊菌门和担子菌门，相对丰度分别为27.89%±2.20%和71.12%±3.00%。由图4可以看出，在鲜马奶样本中，担子菌门为主要的真菌门，其次为子囊菌门。

3个鲜马奶样本共鉴定出67个真菌属，数量明显高于细菌属。样本平均相对丰度大于1%的属有9个，包括红酵母属(Rhodotorula)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、丝孢酵母菌属(Trichosporon)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、黄曲霉(Aspergillus)、Phialemoniopsis、Saitozyma以及子囊菌门中未被分类的一种菌（unclassified_p_Ascomycota）。红酵母属是鲜马奶的优势真菌属，相对丰度55.51%，基于ITS基因高通量测序技术推测它是红酵母属中的胶红酵母种（Rhodotorula mucilaginosa）。

酵母菌对马奶的风味、质地和营养价值有着重要的促进作用[28]。酵母菌产生的酶分解形成脂肪酸，并进一步发生酯化反应得到具有芳香味的酯类[29]，可以与乳酸菌共同分解蛋白质产生大量的氨基酸[30]等。红酵母属广泛存在于食品中，芦文娟发现胶红酵母只存在于原料乳中，而在发酵奶酪中消失[31]。Tahar Amrouche等提到了在骆驼乳中也发现了胶红酵母属的存在，且由于其蛋白水解和脂解活性，可以为最终的产品增添风味和香气[32]。Tezira A等认为胶红酵母属在发酵过程中的存在可能不具有功能意义，因为其在乳制品中的存在被认为是腐败因素，但也可能对风味有一定的影响[33]。此外还发现线黑粉酵母属的物种可以引起真菌疾病（隐球菌病）[34]。以上文献表明，鲜马奶中优势菌属红酵母属的存在，为后续发酵中风味的形成奠定了基础，但其真菌群落组成也表示鲜马奶存在一定的安全风险。

3 结 论

本研究对锡林郭勒地区鲜马奶中的风味物质和微生物多样性进行了测定和分析。鲜马奶中检测到的22种风味物质中，酸类物质种类较多，总酸质量分数约为31.15μg/g，主要有乙酸、辛酸、癸酸、苯甲酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸和亚麻酸。4种芳香族化合物总质量分数为（5.39±0.11）μg/g。除此之外还含有少量的醇类物质、酯类物质和酮类物质。微生物多样性分析结果表明，细菌群落主要包括肠杆菌属、劳特菌属、乳球菌属等，其中肠杆菌属为优势细菌属，相对丰度44.83%。真菌群落主要有红酵母属、线黑粉酵母属、克鲁维酵母属等，其中红酵母属为优势真菌属，相对丰度55.51%。鲜马奶中虽然有较高的微生物多样性，但部分优势菌是致病菌，存在一定的安全隐患。因此，在加工鲜马奶时，建议将原料乳进行杀菌消毒处理，或添加具有高质量微生物的引子抑制污染菌的生长，进一步提升马乳制品的品质。