高效液相色谱-原子荧光光谱法分析新疆（南疆）冻干驴乳粉中硒形态含量

郭金喜，范田丽，郭武军，何晓瑞，周玉贵

(1.新疆维吾尔自治区产品质量监督检验研究院国家农副产品质量监督检验中心，乌鲁木齐 830011；2.乌鲁木齐奶业协会，乌鲁木齐 830011；3.新疆玉昆仑天然食品有限公司,新疆喀什 844400)

0 引 言

硒(selenium，Se)是人体必需的微量元素之一,具有抗氧化、调控人体血脂代谢、增强免疫力、抗肿瘤、预防心肌病等重要功能,因此被誉为“生命之火”。研究表明硒的功能活性和作用机理与摄入硒的化学形态密切相关[1-3]。硒的形主要有无机硒（硒酸盐：Se（Ⅵ）、亚硒酸盐：Se（Ⅳ））和有机硒（硒胱氨酸：SeMet、硒代蛋氨酸：SeCys）两种，硒的不同化学形态对人体的吸收、生物效应、毒性及防癌作用不同，例如硒酸盐和亚硒酸盐等无机硒会导致生物体病变，过多摄入无机硒会引起硒中毒[4-8]，而Se-腺苷-硒半胱氨酸、Se-甲基-硒半胱氨酸、Se-胱硫醚、γ-谷氨酰胺-Se-甲基-硒半胱氨酸等有机硒是人类摄取硒元素的主要来源。新疆驴乳营养价值高，富含蛋白质、脂肪亚油酸、牛磺酸和硒等多种营养物质和微量元素，经检测驴乳粉中硒含量较高，尤其是南疆（岳普湖县）驴乳粉硒含量最高，根据查找资料记载南疆驴乳中硒的含量是牛乳的10倍以上[9-14]。目前对乳粉中硒的形态分型的报道很多，但未见对新疆驴乳粉中硒的形态分析未见报道，所以对新疆驴乳粉中硒的形态分型，确定驴乳粉中硒的形态就显得尤为重要。

硒的形态分型常用的主要有高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪（HPLC-ICP-MS）和高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪（HPLC-HG-AFS）[15]两种分型定量设备，HPLC-ICP-MS具有检出限低、灵敏度高等优势，但其仪器原理复杂，使用成本和操作难度高，而原子荧光光谱仪（HG-AFS）是我国少数具有自主知识产权的中高端分析仪器之一，具有结构简单、分析成本低、灵敏度高、选择性好和线性范围宽等优点[16-18]，所以本文采用高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪（HPLC-HG-AFS）对新疆南疆（岳普湖县）驴乳粉中硒的形态和含量进行分析研究。因为冻干驴乳粉中蛋白质和脂肪含量分别为15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，为了能得更好的提取驴乳粉中硒的各种形态，运用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用作为酶解提取驴乳粉中硒形态的提取方法。

1 实 验

1.1 材料及试剂

冻干驴乳粉，购买国产某品牌（南疆岳普湖县）冻干驴乳粉。

硒单元素标准物质，100 mg/L（GBW 0866）（1%盐酸溶液介质）；硒代蛋氨酸（SeCys）（GBW 10034），39.4±1.0μg/g（以硒计）、97.9±2.5μg/g（以硒代蛋氨酸计）；硒酸根（Se（Ⅵ））（GBW 10033），41.5±1.3μg/g（以硒计）、75.1±2.4μg/g（以硒酸根计）；亚硒酸根（Se（Ⅳ））（GBW 10032），42.9±0.9μg/g（以硒计）、68.9±1.4μg/g（以亚硒酸根计）；硒代胱氨酸（SeMet）（GBW 10087），44.2±1.0μg/g（以硒计）、93.5±2.5μg/g（以硒代胱氨酸计）；均由中国计量院提供。流动相用5 mmoL柠檬酸+0.5 mmoL四丁基溴化铵（TBAB）+2%CH3OH（调解pH=4.5），现用现配；盐酸（优级纯）、甲醇（优级纯），国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1.2 仪器设备

HPLC-AFS9800高效液相色谱-双道原子荧光分光光度计（配有砷-汞空心阴极灯），北京吉天仪器公司；HamiltonPRPX阴离子交换柱（250 mm×4.1 mm、10μm），瑞士汉密尔顿；Agilent M P-C18反相色谱柱（150 mm×4.65 mm、10μm)，美国安捷伦；TOPEX微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司；TS-110X 30恒温水浴振荡器，上海捷呈；PHS-3C数字酸度计，上海楚定分析仪器有限公司；GTSONIC-D 6超声波清洗仪，广东固特超声股份有限公司；BSA124S-CW分析天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；SIGAMA3-30K台式高速型冷冻离心机，德国Sigma。实验用所有玻璃和聚四氟乙烯器皿均以20%（体积分数）的硝酸浸泡24 h，用去离子水冲洗干净。

2 方 法

2.1 样品前处理

2.1.1 总硒提取前处理

由于驴乳粉基体复杂，富含蛋白质和油脂，比常规样品难消化彻底，未确保最大限度的提取驴乳粉中总硒。本方法减少样品称样量，准确称取约0.3～0.5 g（精确至0.0001 g）样品于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸5.0 mL，混合均匀，放置2 h，于通风厨电热炉上220℃进行预消化，待硝酸即将剩余0.5 mL左右取下冷却后补加5 mL硝酸，然后密封好消化管，放入微波消解器，消解完毕后，放入赶酸器种赶酸至约剩0.5 mL，不可蒸干。冷却后，用去离子水少量多次洗涤定容至25 mL容量瓶中摇匀过0.45μm滤膜及C18小柱净化备用。同时做空白实验、样品加标实验、空白加标实验。

2.1.2 硒形态提取前处理

因为新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中蛋白质和脂肪含量很高，分别为15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，为了能得更好的提取驴乳粉中硒的各种形态，采用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用让驴乳粉中蛋白质和脂肪酶解成更易硒形态提取的小分子氨基酸、脂肪酸、酮酸等物质，提高硒形态的提取率。

准确称取0.3 g（精确至0.0001 g）驴乳粉样品于15 mL离心管中，加入混5 mL合酶系列4（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均为0.08 g）、pH=7.5、水浴温度40℃、水浴时间为3 h，对样品进行恒温水浴振荡酶解提取，提取结束于4℃下以10 000 r/min转速离心5 min。取上层清液定容至25 mL容量瓶中摇匀过0.45μm滤膜及C18小柱净化备用。同时做空白实验、样品加标实验、空白加标实验。

2.2 标液配制

标准储备液配制：准确移取硒单元素标准物质溶液1.00 mL，用体积分数0.5%硝酸（以浓硝酸为基准）稀释并定容至100.0 mL容量瓶，配制成浓度为1.0 mg/mL标准储备液；准确称取SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet标准物质2.5380、2.4096、2.3310、2.2624 g用超纯水溶解分别定容至100 mL容量瓶中，制成1.0 mg/mL标准储备液。所有标准储备液冷藏保存，用时逐步稀释。

Se标准工作液配制：临用前将Se标准储备液从冷藏柜种取出，恢复到室温。将恢复到室温的标准储备液分别吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，配置成各点浓度依次为0.0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L标准工作液。

混合标准工作液配置：临用前将SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet标准储备液从冷藏柜种取出，恢复到室温。将恢复到室温的标准储备液分别吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL定容至100 mL容量瓶中，配置成各点浓度依次为0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L混合标准工作液。

2.3 流动相的选择

通过前期试验和查阅资料发现通过运用磷酸氢二铵溶液或者柠檬酸作为流动相时都不能对驴乳粉中硒的形态进行有效分离，磷酸氢二铵溶液作为流动相时不能实现Se（Ⅳ）和SeMet的基线分离，分离效果不好，而采用柠檬酸作为流动相时SeCys和SeMet检测灵敏度会有所下降。本实验采用柠檬酸作为流动相的同时添加一定量的四丁基溴化铵（TBAB），可以有效实现SeCys和SeMet的分离和提高检测灵敏度[19]。本次实验采用5 mmoL柠檬酸+0.5 mmoL TBAB+2%CH3OH溶液作为流动相（pH=4.5）。

2.4 仪器设备参数

测定总硒的样品经过微波消解、赶酸、定容后过0.45μm滤膜，进行上机测定。形态分型样品经过酶提取、离心、定容后过0.45μm滤膜然后上机测定。设备参数见表1,硒形态液相谱图见图1。

表1 设备参数条件

图1 4种硒形态色图谱

2.5 检出限及精密度测定

先对空白样品连续进行21次测定，求出测定值的标准偏差。对样品中4种形态硒标准系列重复测定3次，取算术平均值后，按线性回归法求出标准曲线的相关系数。以3倍空白的标准偏差除以标准曲线的斜率，得到检出限[20]。连续11次重复测标准点浓度为60μg/L的标准溶液，计算RSD值[21]。同事测定空白加标回收率和样品加标回收率，对样品4种形态硒进行分型和含量测定。

3 结果与分析

3.1 硒的测定

准确称取0.3～0.5 g（精确至0.0001 g）驴乳粉样品采用微波消解，消解好样品经冷却定容至15 mL离心管中，过定容后过0.45μm滤膜然后上机测定。采用GB5009.93-2017《食品安全国家标准食品中硒的测定》中第一法（氢化物原子荧光光谱法）对硒含量进行测定。

3.2 酶解提取硒形态参数的确定

准确称取0.3 g（精确至0.0001 g）驴乳粉样品于15 mL离心管中，加标后加入10 mL混合酶（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均为0.08 g）、调解pH值、水浴温度40℃、水浴时间，对样品进行恒温水域振荡酶解提取，提取结束于4℃下以10 000 r/min转速离心5 min。取上层清液定容至25 mL容量瓶中摇匀过0.45μm滤膜及C18小柱净化后上机测定。同时做空白实验、样品加标、空白加标上机测定。确定酶解提取温度、酶添加量、时间、pH值4个因素提取样品中4种形态硒的最佳参数条件。

3.2.1 酶解提取温度的确定

以提取时间为2 h、提取酸pH值为7、提取用蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均为0.04 g为提取条件，确定提取温度分别为30、35、40、45、50时，提取冻干驴乳粉4种硒形态的最佳温度条件。温度对提取效果的影响，见图2。

图2 温度对4种硒形态提取的影响

由图2可以看出在提取温度为40℃时提取效果最好，这表明40℃时酶的活性最好，达到最佳提取效果，温度过高或过低都会影响酶活性，所以本实验采用40℃，作为本次实验的酶解提取温度。

3.2.2 酶解提取酶浓度的确定

以提取时间为2 h、提取酸pH值为7、提取温度为40℃，为提取条件，确定提取酶添加量分别为STD1（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.02 g）STD2（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.04 g）、STD3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）、STD4（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.08 g）、STD 5（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.1 g）时提取冻干驴乳粉4种硒形态的最佳酶浓度条件。

由图3可以看出，在酶添加量为STD3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）时4种形态硒达到最大值，趋于稳定，说明STD3时酶添加量最为合适，酶解达到饱和状态，在多就会出现过饱和，造成酶的浪费，过少提取效果不好。所以本次实验选取酶添加量为STD3作为本次实验酶添加量。

图3 酶添加量对4种硒形态提取的影响

3.2.3 酶解提取时间的确定

以提取pH值为7、温度为40℃、酶添加量为STD3，为提取条件，确定提取时间分别为2、2.5、3、3.5、4 h时提取冻干驴乳粉4种硒形态的最佳时间条件。

由图4可以看出，提取时间在3 h的4种形态硒的提取达到最大值，过后趋于稳定，说明时间3 h时已经最大限度提取样品中4中硒形态，无需增加提取时间来增大提取率，所以本次实验提取时间选取3 h。

图4 提取时间对4种硒形态提取的影响

3.2.4 酶解提取pH的确定

以提取温度为40℃、酶添加量为STD3，时间为3 h，为提取条件，确定提取pH值分别为6.5、7、7.5、8、8.5时提取冻干驴乳粉4种硒形态的最佳pH值条件。

由图5可以看出，在提取pH为7.5时候达到最大值，pH过高或者过低时酶解提取率都会下降，主要原因是选取的酶为弱碱性酶，在酶解pH为7.5的时候效果达到最好，所以每次实验选取酶解提取pH为7.5。

图5 提取pH对4种硒形态提取的影响

本次实验选取酶解提取温度为40℃、时间3 h、酶添加量STD3、pH为7作为本次实验的最佳提取条件。

3.3 硒检测结果

考察硒形态系列标准溶液，在0～100μg/L范围内其线性实验结果。对建立4种形态硒标准系列标准曲线，按线性回归法求出标准曲线的相关系数，对空白溶液、标准溶液进行连续测定，计算准偏差、检出限、RSD值、加标回收率，对样品4种形态硒进行分型和含量测定。

3.3.1 硒形态标准曲线

准确称取SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeM et标准物质2.5380、2.4096、2.3310、2.2624 g用超纯水分别定容至100 mL容量瓶中，制成1 000μg/kg标准储备液，冷藏保存。临用前将4种SeCys、Se（Ⅵ）、Se（Ⅳ）、SeMet标准储备液从冷藏柜种取出，恢复到室温。将恢复到室温的标准储备液逐步稀释，配置成各点浓度依次为0.0、10、20.0、40.0、80.0、100.0μg/L混合标准工作液。详见图6～7。

图6 4种硒形态标准系列液相图谱

图7 4种硒形态标准系列曲线

3.3.2 线性范围及检出限

建立4种硒形态标准曲线，对空白样品连续进行21次测定，求出测定值的标准偏差。按线性回归法求出标准曲线的相关系数。以3倍空白的标准偏差除以标准曲线的斜率，得到检出限。连续11次重复测标准点浓度为60μg/L的标准溶液，计算RSD值。同时测定空白加标回收率和样品加标回收率，对样品4种形态硒进行分型和含量测定。结果见表2。

由表2可知，HPLC-HG-AFS测定新疆南疆（岳普湖）冻干驴乳粉中4种硒形态r2在0.9993～0.9998之间、检出限为0.3μg/kg、定量限为1μg/kg之间、RSD在0.98%～1.03%之间，结果表明本研究方法检出限、定量限低、精密度，结果稳定，完全满足检验要求。

表2 4种硒形态测定的回归方程、相关系数、检出限、定量限、RSD

3.3.3 样品加标测定结果

按酶解提取的前处理最佳酶解提取温度为40℃、时间3 h、酶添加量STD3、pH为7作对处理加标实验样品。对3组样品进行加标实验，用时做空白加标实验，加标实验结果见表3。

由表3可以看出3种硒形态Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）样品加标回收率在88.1%～95.2%之间，而SeCys的样品加标回收为30.5%～39.4%，不超过40%，但是空白加标四种硒形态回收率在99.5%～101.7%之间结果很好。这是由于该方法提取驴乳粉中SeCys的时候，由于（SeCys）2中的Se-Se化学键不稳定，容易断开且易与乳粉中的蛋白质吸附沉淀。但是Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3种硒形态样品加标回收率在88.1%～95.2%之间，表明这3种形态硒的分型检测没有问题，本实验运用测定冻干驴乳粉中总硒含量，然后减去测定的Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3种硒形态含量得到SeCys的形态含量。

表3 样品加标回收结果

3.3.4 硒形态含量测定结果

通过测定样品中总硒、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）含量，用总硒含量减去Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3种硒形态含量计算出SeCys含量，有机硒含量，详见表4。

由表4可以看出SeMet含量在10.43～12.79μg/kg之间，占总硒含量的55.1%～77.9%，SeCys含量4.06 μg/kg～7.76μg/kg，占总硒含量的22.1%～39.4%，有机硒（SeM et和SeCys总量）含量在16.68～18.60μg/kg，占总硒含量的94.4%～100.0%。除2#、6#、9#样品分别含有1.08μg/kg、1.00μg/kg、1.03μg/kg的Se（Ⅵ），其它7个样品均未检出无机硒。结果显示新疆南疆冻干驴乳粉中有机硒含量在16.68～18.60μg/kg之间占总硒在94.4%～100.0%，含有少量或不含有无机硒。

表4 样品分析结果

4 结果与讨论

本实验通液相色谱-原子荧光光谱（HPLC-HGAFS）联用仪检测新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中硒形态含量，流动相对于分离硒形态有着很大的影响，通过前期实验和查阅资料发现通过运用磷酸氢二铵溶液或者柠檬酸作为流动相时都不能对驴乳粉中硒的形态进行有效分离，磷酸氢二铵溶液作为流动相时不能实现Se（Ⅳ）和SeMet的基线分离，分离效果不好，而采用柠檬酸作为流动相时SeCys和SeMet检测灵敏度会有所下降。本实验采用柠檬酸作为流动相的同时添加一定量的四丁基溴化铵（TBAB），可以有效实现SeCys和SeMet的分离和提高检测灵敏度。流动相为5 mmoL柠檬酸+0.5 mmoL TBAB+2%CH3OH溶液作为流动相（pH=4.5）。

因为新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中蛋白质和脂肪含量很高，分别为15.97%～21.60%和9.50%～14.60%，为了能得更好的提取驴乳粉中硒的各种形态，采用蛋白酶和脂肪酶的混合酶共同作用让驴乳粉中蛋白质和脂肪酶解成更易硒形态提取的小分子氨基酸、脂肪酸、酮酸等物质，提高硒形态的提取率。但是酶法提取对酶的添加量、温度、pH、时间等提取条件要求很严格，所以本方法探讨优化了酶法提取驴乳粉中硒形态的参数条件，研究得出结论酶法提取最佳参数条件为温度40℃、时间3 h、酶添加量STD 3（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶均0.06 g）、pH为7。

冻干驴乳粉中3种硒形态Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）样品加标回收率在88.1%～95.2%之间，而SeCys的样品加标回收为30.5%～39.4%，不超过40%，但是空白加标4种硒形态回收率在99.5%～101.7%之间结果很好。这是由于该方法提取驴乳粉中SeCys的时候，由于（SeCys）2中的Se-Se化学键不稳定，容易断开且易与乳粉中的蛋白质吸附沉淀，致使加标回收率下降。但是Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3种硒形态样品加标回收率在88.1%～95.2%之间，表明这3种形态硒的分型检测没有问题，本实验运用测定冻干驴乳粉中总硒含量，然后减去测定的Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）3种硒形态含量得到SeCys的形态含量，很好的计算了新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中总硒、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）、SeCys含量和占比。

新疆驴乳营养价值高，富含蛋白质、脂肪亚油酸、牛磺酸和硒等多种营养物质和微量元素，经检测驴乳粉中硒含量较高，尤其是新疆南疆（岳普湖县）驴乳粉硒含量最高。研究表明硒的功能活性和作用机理与摄入硒的化学形态密切相关。硒的形主要有无机硒有机硒，硒的不同化学形态对人体的吸收、生物效应、毒性及防癌作用不同，无机硒会导致生物体病变，而有机硒是人类摄取硒元素的主要来源，所以过多摄入无机硒会引起硒中毒。本实验通过HPLC-HG-AFS法测定新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中硒形态，结果显示新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中硒形态中有机硒含量在在16.68～18.60μg/kg之间，占总硒含量的94.4%～100.0%，含有很少或者不含无机硒。研究表明新疆南疆（岳普湖县）冻干驴乳粉中硒含量丰富且都是人体有益的有机硒。