5种尿液修饰核苷联合血浆EBV-DNA定量检测在鼻咽癌诊断中的可行性研究

茅飞霞 张毅敏 张剑英▲

1.中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）检验科，浙江杭州 310022；2.中国科学院基础医学与肿瘤研究所，浙江杭州 310022

鼻咽癌是一种发生在鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，具有明显的地域聚集性，以我国南方和东南亚地区常见。该病起病隐匿，大部分患者确诊时已是中晚期，临床治疗效果不佳，因此在目前病因不明无法进行一级预防的情况下，准确的早期诊断是鼻咽癌防治的关键。现已公认，Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染是鼻咽癌发生发展的关键[1]，但是单纯EBV感染并不一定引起鼻咽癌的发生。RNA修饰核苷是机体RNA的代谢产物，尿中修饰核苷的排量可以反映机体细胞的代谢速度，相关研究发现这些修饰核苷与肿瘤发生有关，是潜在的肿瘤标志物，具有肿瘤谱广、取材方便、稳定性好等特点[2]。本研究通过检测鼻咽癌患者尿液中假尿嘧啶核苷（pseudouridine，Pseu）、1-甲基腺苷（1-methyladenosine，m1A）、2-甲基鸟苷（2-O-methylguanosine，m2G）、6-甲基腺苷（6-methyladenosine，m6A）和1-甲基鸟苷（1-methylguanosine，m1G）5种修饰核苷的浓度以及血浆EBV-DNA的拷贝数，旨在探讨尿液5种修饰核苷与血浆EBV-DNA联合检测在鼻咽癌诊断中的可行性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1～6月浙江省肿瘤医院收治的56例初诊鼻咽癌患者作为鼻咽癌组，男36例，女20例；年龄15～73岁，平均（52.68±13.26）岁。鼻咽癌按照第8版AJCC的分期标准[3]，临床分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期3例，Ⅲ期23例，Ⅳa期20例，Ⅳb期7例；淋巴结转移程度：N05例，N121例，N223例，N37例。纳入标准：①经病理组织学证实为鼻咽癌；②全部接受抗肿瘤治疗前。排除标准：①存在影响RNA代谢的疾病，如泌尿系感染和肾功能不全、内分泌异常、酗酒等情形；②合并鼻咽癌外其他脏器的恶性肿瘤病史。同时选取门诊查体的32例健康体检者作为正常对照组，男19例，女13例；年龄25～68岁，平均（49.25±11.86）岁。两组的性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经浙江省肿瘤医院医学伦理委员会审查批准并征得患者及其家属知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采用液相色谱-串联质谱方法检测尿液中5种核苷的浓度

1.2.1.1 仪器和试剂AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500超高效液相色谱串联质谱仪，配有Analyst 1.4数据处理系统（美国AB SCIEX公司）。5种修饰核苷标准品分别为Pseu、m1A、m6A、m1G（加拿大TRC公司）及m2G（中国Meryer公司）。

1.2.1.2 尿样预处理 鼻咽癌组患者于治疗前采集尿样，健康体检者采集随机尿样。样本收集后存放于-80℃冰箱，测定前室温复溶。4℃15 000 r/min离心15 min，取上清100 μL至15 mL离心管内，再加入4900 μL超纯水，涡旋10 min。取上述稀释后样本100 μL于1.5 mL离心管中，再加入100 μL内标溶液，4℃13 000 r/min离心10 min，取上清进样分析。

1.2.1.3 色谱条件 选用Agilent Proshell 120 EC-C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）；流动相（A）为0.1%甲酸/水溶液，流动相（B）为0.1%甲酸/甲醇溶液；梯度洗脱：0～0.5 min，1% B；0.5～8.0 min，1%～15% B；8～9 min，15%～100%B；9～10 min，100%B；10.0～10.5 min，100%～1% B；10.5～12.0 min，1% B。进样量15 μL，流速为0.3 mL/min；柱温为30℃。

1.2.1.4 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。离子源参数：气帘气压为20 Psi，碰撞气压为8 Psi，离子喷雾电压为5500 V，离子源温度为550℃。

1.2.1.5 肌酐值测定 以随机尿样为研究对象，采用日立7100型全自动生化分析仪检测肌酐浓度（酶法测定），严格按照说明书操作。以核苷与肌酐浓度比值[nmol/μmol（creatinine）]为研究指标，反映尿液中核苷的水平。

1.2.2 采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术检测EBV-DNA的拷贝数

1.2.2.1 样本预处理 采集静脉血3 mL，加入EDTA抗凝管中，2000 r/min离心5 min，取200 μL血浆于-20℃冻存备用。

1.2.2.2 EBV-DNA的提取及PCR扩增 将冻存血浆置于室温环境复溶，严格按照EBV荧光定量PCR检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）说明书进行DNA提取。将混合的PCR反应液在LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量RCR仪（瑞士Roche公司）上进行基因扩增检测，PCR反应条件：93℃预变性2 min，93℃5 s，57℃45 s，40个循环，37℃冷却。

1.3 观察指标

比较两组的血浆EBV-DNA拷贝数、尿液中5种修饰核苷浓度，分析尿液m2G、m1A、Pseu、m1G与鼻咽癌临床分期和淋巴结转移的关系，并分析血浆EBV-DNA与尿液m2G、m1A、Pseu、m1G单独及5项联合检测诊断鼻咽癌的价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验；部分计量资料偏态分布用中位数（四分位数）表示，组间比较采用Mann-Whitney非参数检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析；利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析单项或多项联合检测的诊断效能，多项指标联合诊断先通过Logistic回归形成联合预测因子再构建ROC曲线，ROC曲线下面积（AUC）比较采用Z检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血浆EBV-DNA拷贝数的比较

鼻咽癌组的血浆EBV-DNA拷贝数为108 copies/mL（0～4340 copies/mL），正常对照组的血浆EBV-DNA拷贝数为55 copies/mL（0～1326 copies/mL），两组比较，差异有统计学意义（Z=3.478，P=0.001）。

2.2 两组尿液中5种修饰核苷浓度的比较

鼻咽癌组尿液中的m2G、Pseu、m1A、m1G浓度均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组尿液中的m6A浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 两组尿液中5种修饰核苷浓度的比较[nmol/μmol（creatinine），±s]

表1 两组尿液中5种修饰核苷浓度的比较[nmol/μmol（creatinine），±s]

鼻咽癌组正常对照组t值P值56 32 1.17±0.31 0.74±0.22 6.980 0.000 38.16±9.01 29.52±6.15 5.307 0.000 4.94±1.20 3.53±0.75 6.821 0.000 0.01±0.01 0.01±0.01 1.155 0.251 0.97±0.21 0.69±0.18 6.255 0.000组别 例数 m2G Pseu m1A m6A m1G

2.3 尿液Pseu、m1A、m1G、m2G与鼻咽癌临床分期和淋巴结转移的关系

单因素分析结果显示，不同临床分期的Pseu浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同淋巴结转移程度的Pseu、m2G浓度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同临床分期的m1A、m1G、m2G浓度比较及不同淋巴结转移程度的m1A、m1G浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 尿液Pseu、m1A、m1G、m2G与鼻咽癌临床分期和淋巴结转移的关系[nmol/μmol（creatinine），±s]

表2 尿液Pseu、m1A、m1G、m2G与鼻咽癌临床分期和淋巴结转移的关系[nmol/μmol（creatinine），±s]

临床分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期Ⅳa期Ⅳb期淋巴结转移N0 N1 N2 N3 6 23 20 7 52 1 23 7 25.03±8.56 37.38±6.49 40.41±8.40 45.51±7.77 28.20±9.09 36.83±9.71 39.45±5.61 45.30±10.17 8.840 4.494 0.000 0.007 4.40±1.22 4.67±0.92 5.13±1.36 5.72±1.24 3.73±0.89 4.90±1.38 5.13±0.94 5.32±1.13 2.058 2.279 0.182 0.090 0.92±0.19 0.95±0.21 1.01±0.19 1.06±0.26 0.86±0.24 0.94±0.20 0.97±0.19 1.12±0.20 1.894 1.796 0.153 0.159 0.94±0.19 1.14±0.25 1.24±0.37 1.26±0.31 0.90±0.11 1.19±0.29 1.12±0.22 1.46±0.48 1.829 4.156 0.153 0.010项目 例数 Pseu F值 P值 m1A F值 P值 m1G F值 P值 m2G F值 P值

相关分析结果显示，Pseu浓度与临床分期及淋巴结转移均呈正相关（r=0.474、0.406，P＜0.01）；m2G浓度与淋巴结转移无相关性（r=0.259，P＞0.05）。

2.4 血浆EBV-DNA与尿液m1A、Pseu、m2G、m1G单独及5项联合检测诊断鼻咽癌的ROC曲线分析

通过Logistic回归形成m2G、m1A、Pseu、m1G及EBV-DNA 5项联合检测的联合预测因子，将联合预测因子作为新变量与EBV-DNA、m2G、m1A、Pseu、m1G一起进行ROC曲线分析并进行诊断效能的评价，结果见表3、图1（封三）。Z检验结果显示：5项联合检测的AUC均高于血浆EBV-DNA和尿液m2G、m1A、Pseu、m1G单项检测（Z=4.655、3.010、3.484、4.222、3.484），差异均有统计学意义（P＜0.05）。在特异性为90%时，血浆EBV-DNA和尿液Pseu、mlA、mlG、m2G单项检测的敏感度分别为46.4%、51.8%、57.1%、53.6%、76.8%，而5项联合检测的敏感度可达89.3%。

表3 血浆EBV-DNA与尿液m1A、Pseu、m2G、m1G单独及5项联合检测诊断鼻咽癌的AUC

图1 血浆EBV-DNA与尿液m1A、Pseu、m2G、m1G单独及5项联合检测诊断鼻咽癌的ROC曲线

3 讨论

根据2019年《鼻咽癌标志物临床应用专家共识》[4]，血浆EBV-DNA是目前临床应用最广泛、最成熟的鼻咽癌诊断、疗效和预后判断标志物。本研究结果显示，鼻咽癌患者与对照组比较，其EBV-DNA拷贝数升高（P＜0.05），再一次证实EB病毒感染与鼻咽癌发生的密切相关。此外，本研究中鼻咽癌患者血浆EBV-DNA拷贝数为107copies/mL（0～4340 copies/mL），明显低于相关文献报道数据[5-6]。王惠丽等[7]研究发现，治疗前鼻咽癌患者血浆血浆EBV-DNA拷贝数为134 copies/mL，与本研究结果相似，分析原因认为可能与接受治疗的患者主要祖籍为北方而非来自鼻咽癌高发区有关。Alfieri等[8]发现意大利非高发区患者治疗前EBV-DNA的中位拷贝数数为554 copies/mL，也明显低于高发区患者的水平。由此认为本研究中患者治疗前血浆EBV-DNA水平较低可能与研究对象来自东部并非来自鼻咽癌高发区有关，具体机制有待进一步研究证实。

RNA修饰核苷属于内源性小分子，主要存在于tRNA中[9]，由RNA转录后在多种特异性修饰酶，尤其是甲基转移酶和连接酶的作用下，RNA链上特定位置的核苷被修饰而形成。修饰核苷不能被机体重新利用而在尿中定量排放，肿瘤细胞核糖核酸周转加快，导致其产生和排出增多。目前已发现的修饰核苷有90多种，近年来的研究发现其中有二十多种修饰核苷是非常有潜力的分子标志物，在多种类型肿瘤患者尿液中排放水平较正常人显著升高[10-12]。

Pseu是被研究得最多的一种修饰核苷[11]。尿嘧啶与核糖在核苷磷酸酶的作用下生成尿嘧啶核苷，之后被尿苷激酶催化生成尿嘧啶核苷酸，经tRNA合成酶催化特定部位尿嘧啶核苷酸形成Pseu[13]。在包括前列腺癌、卵巢癌、肺癌等多种常见肿瘤中均发现患者尿液中Pseu浓度较正常对照显著升高，被认为是核苷中最有潜力的广谱分子标志物[10-11，14]。Pérez-Rambla等[10]在建立评估前列腺癌尿液代谢组学模型研究中发现，与前列腺良性增生患者比较，前列腺癌患者尿液Pseu显著升高（P＜0.05）。本研究结果显示，鼻咽癌患者尿液Pseu浓度与对照组比较显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），与Trewyn等[15]研究结果相似。利用ROC曲线进行诊断效能的评价，显示其具有较高的诊断价值（AUC=0.803），提示Pseu可能是鼻咽癌的一种分子标志物，有助于鼻咽癌的诊断。另外，相关分析结果显示，Pseu浓度与临床分期和淋巴结转移均呈正相关（P＜0.05），与Jiang等[14]卵巢癌中的研究结果相似，提示Pseu可能参与鼻咽癌的进展和演进过程。

在尿液修饰核苷产生过程中，甲基转移酶发挥重要作用[16]。在肿瘤细胞中，由于编码甲基转移酶的基因表达异常，其水平和活性发生异常[17]，从而导致修饰核苷水平增高。在所有核苷修饰类型中，甲基化是最常见的修饰，m2G、m1A、m1G均属于甲基化修饰的核苷[18]。冯璐等[19]等研究发现肺癌患者尿液中mlA、mlI、mlG及m2G浓度均显著高于正常对照者（P＜0.01），认为尿液中4种修饰核苷可能成为肺癌诊断的分子标志物。本研究中，鼻咽癌组尿液中的m2G、m1A、m1G浓度均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），m2G、m1A、m1G的AUC分 别 为0.911、0.860、0.845，具有较高的诊断价值，提示该3种修饰核苷可能是鼻咽癌诊断的分子标志物。此外，本研究进一步采用Logistic回归和ROC曲线分析，结果显示，m2G、m1A、Pseu、m1G、EBV-DNA 5项联合检测的AUC均高于m2G、m1A、Pseu、m1G、EBV-DNA单项检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；在特异性为90%时，血浆EBV-DNA和尿液Pseu、mlA、mlG、m2G单项检测的敏感度分别为46.4%、51.8%、57.1%、53.6%、76.8%，而联合检测的敏感度可达89.3%。提示5项联合检测在鼻咽癌可能具有较高的诊断价值，且可能有助于提高诊断的敏感度。

综上所述，鼻咽癌患者尿液中修饰核苷m2G、m1A、Pseu、m1G有望成为诊断鼻咽癌的小分子标志物，Pseu可能参与鼻咽癌的发展演进过程。通过m2G、m1A、Pseu、m1G与EBV-DNA联合检测可能有助于提高鼻咽癌临床诊断的诊断效能，有利于患者的早诊断、早发现，具有较好的临床前景。