弥漫大B细胞淋巴瘤患者化疗前后淋巴细胞亚群动态变化及其意义

余 璐 丁凯阳

1.安徽医科大学附属省立医院血液科，安徽合肥 230032；2.安徽医科大学附属省立医院血液肿瘤科，安徽合肥 230032

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中的一种，其约占成人NHL的30%～40%[1]。随着医疗水平的提高有更多患者可被诊断，而且随着各种治疗手段的应用，DLBCL患者的生存期明显延长，但是，仍有约30%～40%患者出现疾病复发或难治，预后较差[2]。近年，细胞免疫治疗在淋巴瘤中广泛应用，外周血T细胞亚群在正常人群中作用十分重要，它是细胞免疫的重要组成部分，机体免疫力改变时它也会随之发生一系列的改变。B细胞相关淋巴瘤与外周血免疫功能状态的研究结果提示，B细胞相关淋巴瘤患者淋巴细胞亚群存在变化，目前很多药物也是依赖淋巴细胞发挥作用的，这些新的治疗方法为恶性血液病的治疗带来了新的方向[3]。但是，目前缺乏对淋巴细胞亚群与弥漫大B细胞淋巴瘤预后之间的研究，本研究对56例DLBCL患者的临床病理特征进行了分析，旨在探索DLBCL治疗前后的免疫功能是否存在变化，化疗前后淋巴细胞亚群发生何种变化，探讨不同临床特征的DLBCL患者对预后的影响，以期初步建立外周血淋巴细胞亚群与DLBCL预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性选取安徽医科大学附属省立医院2018年5月～2020年5月首次就诊的56例DLBCL患者作为研究对象，所有患者均经病理确诊，按照化疗前外周血CD4+/CD8+比值分为升高/正常组（A组）39例和降低组（B组）17例。A组中，男24例，女15例；年龄25～78岁，平均（57.3±10.9）岁；病程7～31个月。B组中，男9例，女8例；年龄28～85岁，平均（58.4±14.0）岁；病程11～32个月。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：①年龄≥18岁；②所有患者均符合《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南（2013年版）》[4]；③美国东部肿瘤协作组（ECOG）评分标准[5]体力评分0～3分；④可接受标准的R-CHOP方案化疗。排除标准：①目前患有其他恶性肿瘤，或既往患有恶性肿瘤未行根治性治疗，近5年内复发或转移；②合并无法控制的、严重的心脑血管疾病，如不稳定性心绞痛、心肌梗死、需要治疗的心房纤颤、Ⅱ级以上心力衰竭等；③合并活动性出血或有明确出血倾向者；④有深静脉血栓或肺栓塞病史者；⑤活动性感染或未控制的乙型病毒性肝炎（HBV）、丙型肝炎抗体（HCVAb）阳性、艾滋病（AIDS）或其他严重感染性疾病；⑥既往或目前有肺纤维化、间质性肺炎、尘肺、放射性肺炎、药物相关肺炎、肺功能严重受损等；⑦存在精神认知障碍；⑧妊娠及哺乳期妇女；⑨合并风湿免疫功能性疾病；⑩其他不适用美罗华或CHOP的疾病或情况。

1.2 方法

根据患者情况制定个体化的化疗药物及剂量，以标准R-CHOP[6]为基础，具体如下。

d 0，利妥昔单抗（R）[Roche Pharma（Schweiz）AG；规格：100 mg/10mL；国药准字：S20170002]375 mg/m2；d1，环磷酰胺（C）（江苏恒瑞医药股份有限公司；规格：0.2 g；国药准字：H32020857）750 mg/m2，表柔比星（H）（瀚晖制药有限公司；规格：10 mg；国药准字：H19990280）70 mg/m2，长春新碱（O）（山西振东泰盛制药有限公司；规格：1 mg；国药准字：H14020811）1.4 mg/m2；d 1～5，泼尼松（P）（山东新华制药股份有限公司；规格：5 mg；国药准字：H37020647）60 mg/m2。每21天一个周期，化疗同时给予止吐，水化、碱化及其他对症治疗。

R-CHOP方案化疗四周期后进行中期评估。评估结果适合移植患者采用移植强化治疗，或者根据患者病情调整使用二线治疗方案、CRT-T治疗方案等，根据患者的年龄、脏器功能状态等综合因素考虑是否加用或减少化疗药物剂量。患者空腹时采集外周血，完成生化、血常规、T细胞亚群水平的检查，使用流式细胞学技术对患者外周血的淋巴细胞亚群的数目进行计数，包括淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+（简称为CD4+）、CD3+CD8+（简称为CD8+）、CD3+CD4+/CD3+CD8+（简称为CD4+/CD8+）化疗前后的动态变化情况，结果用百分数（%）表示。该项检查由检验科专业医师完成，使用化疗药物前行影像学检查，包括PET-CT、脏器彩超及脏器CT。

1.3 观察指标及评价标准

观察患者的临床特征、化疗前后淋巴细胞亚群的变化、患者的预后及不良反应发生情况。

1.3.1 临床特征 记录比较患者的性别、年龄、病变部位、Ann Arbor分期、血清乳酸脱氢酶（LDH）水平、双表达情况、β2微球蛋白、ECOG评分、有无B症状。其中LDH正常值范围120～250 IU/L，β2微球蛋白＞1.80 mg/L为升高。双表达的定义为患者的病理组织经免疫组化检查后MYC和B细胞淋巴瘤/白血病基因2（BCL-2）表达分别达到40%以上和70%以上[6-7]。

1.3.2 化疗前后淋巴细胞亚群的变化CD3+正常值范围59.4%～84.6%；CD4+正常值范围28.5%～60.5%；CD8+正常值范围11.1%～38.3%；CD4+/CD8+正常值范围1.10%～1.72%。

1.3.3 化疗后情况 化疗四个周期后，按照《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南（2013年版）》[4]对患者治疗效果进行评估，包括行全身PET-CT、外周血检验及骨髓检查，评估结果包括：完全缓解（CR）即病灶疾病消失、部分缓解（PR）即病灶明显减少、稳定（SD）即病灶无明显改变和进展（PD）即有新病灶出现，有效包括CR及PR，无效包括SD和PD。记录患者的随访时间及无进展生存时间。无进展生存时间为从开始治疗到疾病复发/进展或任何原因死亡或随访终点的时间。

1.3.4 不良反应 化疗四周期后再按照外周血CD4+/CD8+比值分为升高/正常组（C组）和降低组（D组），比较两组不良反应发生情况，包括粒细胞减少、血小板减少、贫血及肝功能损害。

1.4 统计学方法

所有的数据采用SPSS 23.0软件进行统计分析；对于符合正态正态分布的计量资料，用均数±标准差（±s）的形式进行描述，采用独立样本t检验，对于不符合正态分布的资料，用中位数（下四分位数，上四分位数）[M（P25，P75）]进行描述，组间比较采用非参数检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL患者化疗后的整体情况

56例DLBCL初诊患者中，45例患者存在结外病变，11例患者未发生结外病变。化疗四个周期后全身PET-CT结果提示，CR者41例，符合淋巴瘤完全缓解的表现，PR者12例，SD者2例，PD者1例。中期评估结果，治疗有效53例，无效3例。所有患者随访至2020年12月10日，随访时间7～31个月，中位随访时间为18个月，到随访结束时共有10例患者病情进展（其中死亡1例），病情稳定者46例。

2.2 DLBCL患者临床特征分布情况

初诊患者CD4+/CD8+比值与性别、年龄、病变部位、ECOG、血清β2微球蛋白水平、是否双表达及有无B症状无明显相关性（P＞0.05），而与Ann Arbor分期、血清LDH水平有关，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 DLBCL患者临床特征分布情况[M（P25，P75）]

2.3 化疗前后淋巴细胞亚群变化情况

化疗后患者的CD3+、CD8+高于化疗前，CD4+/CD8+低于化疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。而CD4+化疗前后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 化疗前后淋巴细胞亚群变化情况（±s）

表2 化疗前后淋巴细胞亚群变化情况（±s）

治疗前治疗后t/U值P值70.833±12.520 79.535±9.600 5.605 0.000 39.058±10.812 40.034±11.040 0.608 0.546 28.920±9.208 36.590±11.067 6.360 0.000 1.335（1.025，1.775）1.135（0.770，1.545）5.388 0.000时间 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+/CD8+[M（P25，P75）]

2.4 A组和B组患者化疗后情况的比较

A组复发/进展3例（7.69%），B组复发/进展7例（41.18%），B组复发/进展患者人数多于A组，差异有统计学意义（χ2=9.049，P=0.006）。

A组和B组无进展生存时间的中位时间分别为17个月和15个月，A组患者的无进展生存时间为（18.0±7.0）个月，长于B组的（12.5±6.6）个月，差异有统计学意义（t=1.575，P＜0.05）。

2.5 C组和D组患者不良反应发生情况

化疗四周期后再按照外周血CD4+/CD8+比值分为升高/正常组（C组）31例和降 低组（D组）25例。两组患者粒细胞减少、贫血及肝功能损害发生情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），D组血小板减少的发生率高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 C组和D组患者治疗后不良反应分布情况比较[n（%）]

3 讨论

DLBCL是全世界范围内最常见的NHL，约占NHL的30%～40%[1]。DLBCL恶性程度高，随着靶向治疗研究的深入，已经建立针对CD20+的DLBCL患者的治疗标准方案，即R-CHOP方案（美罗华、环磷酰胺、表柔比星、长春新碱、泼尼松）[8]。目前外周血LDH、β2微球蛋白已经被证明是与DLBCL预后相关的因素[9]。大多数患者经过规律的R-CHOP方案治疗后可以达到缓解，但是仍有约40%的DLBCL患者会进展为难治性淋巴瘤，甚至在缓解一段时间后出现病情复发[6]，故改善一线治疗方案的效果一直是国内外血液肿瘤学专家关注的重点。为了让更多的肿瘤患者受益，专家学者们做出了不少努力，值得注意的是基于免疫的诊疗彻底改变癌症治疗的临床治疗预后，目前新的治疗方式广泛地应用到DLBCL的治疗中[10]，主要包括伊布替尼（I）[11]、来那度胺[12]、自体干细胞移植[13]（auto-HSCT）以及嵌合抗原受体T细胞[14]（CAR-T）及双特异性抗体[15]等。这些治疗方案发挥作用时都或多或少与淋巴细胞亚群分布相关。

外周血T细胞亚群在正常人群中作用十分重要[16]，它是细胞免疫的重要组成部分，机体免疫力改变时它也会随之发生一系列的改变。机体细胞免疫主要是依托于淋巴细胞亚群发挥作用的，其中实验室检测中CD3+细胞是代表总的T细胞数量，包括效应性CD4+和细胞毒性CD8+淋巴细胞以及调节性T细胞（Tregs）；辅助性T细胞（Th）是指CD4+淋巴细胞，CD8+淋巴细胞则具有抑制诱导及细胞毒性功能[17]。CD8+是常表现细胞毒活性，一般来说，CD8+含量愈高，患者的免疫抑制愈强，患者的抵抗力愈弱，CD4+/CD8+在一定程度上更能反应机体的免疫功能，即其比值降低时免疫功能降低，比值升高时免疫功能增强。

此前，有研究表明恶性肿瘤患者存在免疫力低下的情况，同时恶性肿瘤患者的病情发生进展与机体的免疫功能之间有着紧密的联系，检测恶性肿瘤患者外周血细胞亚群有助于了解患者机体免疫功能状况[18]。研究NHL患者外周血T细胞亚群后发现NHL患者化疗后CD3+、CD4+细胞百分比均显著增高，CD8+百分比显著降低[19]，此外冉隆荣等[20]对恶性血液病研究中发现15例NHL患者CD4+显著下降、CD8+比例显著上升，而非血液系统恶性病变研究[21]发现患者全血T淋巴细胞总数以及其各个亚群细胞都是明显降低的。虽然，关于淋巴细胞亚群在恶性肿瘤中动态改变的研究并不少，而且均提示恶性肿瘤患者存在不同程度的免疫功能失调，但是目前关于DLBCL患者体内淋巴细胞亚群分布情况的研究数据还不够完善，因此本研究分析初诊DLBCL患者外周血淋巴细胞亚群检测结果有助于进一步了解患者的免疫功能状态。

本研究显示初诊患者外周血T细胞亚群分布情况发现初诊DLBCL患者的免疫功能并不是都受到抑制，只有30%左右患者的CD4+/CD8+出现下降，这可能与淋巴瘤一般以无痛性包块发病，患者常常在体表可扪及肿大的包块，而且这些包块不像炎症包块那样可以自动消退，这种特别的临床表现经常会引起患者的重视而就诊，因此，大多数患者从起病到确诊的时间相对短于其他肿瘤确诊时间，可能正是源于这点，DLBCL患者机体免疫力还没破环的相对少；另外，通过随访发现初始免疫功能受到抑制的患者中有47%发生疾病进展，预后相对于初诊免疫功能正常的患者差，这提示我们免疫功能缺陷会影响化疗的效果，因此，针对免疫功能受到抑制的患者在进行R-CHOP化疗时可适当使用一些增强免疫力的食物或者药物，在治疗期间保证适量的蛋白和维生素的摄取以期增加患者免疫力。

此外，经过四个周期R-CHOP方案化疗后DLBCL患者外周血中的T淋巴细胞亚群分布发生了较大的改变，一方面，患者CD3+和CD8+较化疗前明显升高，另一方面，患者的CD4+/CD8+比值明显下降，两者比值反映初诊患者经过联合化疗后免疫功能受到一定程度抑制，说明首次接受R-CHOP样化疗方案后患者的普遍出现免疫功能下降，发生这样的改变可能是因为常规化疗产生耐药或化疗对机体免疫功能的破坏后T淋巴细胞恢复周期有关[22]。

本研究结果亦显示，首诊DLBCL患者中，Ann Arbor分期越迟的患者相对于分期早的患者的免疫功能低下，而且LDH升高明显的患者免疫功能也存在一定程度的抑制，考虑到Ann Arbor分期较晚和LDH升高的DLBCL患者免疫功能通常存在不同程度的抑制或是受损，在临床中对于LDH升高及Ann Arbor分期较晚的患者在治疗方案的剂量选择及预防不良反应应予以重视以提高患者的生活质量。

另外，本研究发现免疫功能出现抑制后会发生各种不良反应，而且发生血小板减低者的患者免疫功能出现明显抑制，血小板在之止血过程中承担着重要作用[23]，因此，对于免疫功能下降患者也需要注意患者的出血风险，警惕脏器内出血。另一方面，不同免疫功能状态患者发生进展及不良反应的风险也不一样，化疗过程中的不良反应将在一定程度上影响患者生存质量及药物作用的发挥。因此，患者处于免疫功能不同接受R-CHOP治疗可以适当调整免疫靶向药物的剂量以降低药物的免疫抑制作用，从而提高患者的免疫功能，进而减少不良反应，对改善DLBCL患者的生存质量有积极作用。

综上所述，经受化疗的DLBCL患者免疫功能受到一定程度的抑制，动态监测患者的淋巴细胞亚群分布情况可以及时观察到患者体内是否存在免疫功能紊乱，可以及时采取一些合适的干预手段，淋巴细胞亚群细胞分布监测作为一种简单易行的临床检测手段希望可以在更多的淋巴瘤患者中得到应用，以期更好的评估患者免疫功能，从而在一定程度上改善患者预后。