基于网络药理学探讨肛肠瘙痒洗剂治疗肛周湿疹的作用机制

来丽霞， 王晏美， 谷 超， 白彦萍

肛周湿疹是发生于肛门周围特殊部位的湿疹，具有湿疹的普遍特点，但因肛门特殊的位置解剖结构，常导致急性、亚急性肛周湿疹迁延不愈形成慢性肛周湿疹，严重影响患者生活质量，部分患者伴有焦虑、精神紧张、失眠等精神改变[1-2]。肛肠瘙痒洗剂是治疗肛周湿疹的坐浴药物，通过肛门局部熏洗坐浴，有效避免肝脏的“首过效应”[3]，避免药物经过胃肠道破坏及其他药物相互作用等影响吸收的负面因素，可以使药物直达病所，快速发挥作用，其可行性及安全性高，能预防慢性肛周湿疹的复发，不增加患者不良反应[4]。前期临床研究表明，肛肠瘙痒洗剂具有良好的改善皮损修复和减轻瘙痒的效果[5]，为了系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，借助网络药理学“疾病－基因－靶点－药物”多层次、多角度的相互作用理念，力求从系统层面揭示肛肠瘙痒洗剂治疗肛周湿疹的多成分、多靶点、多通路复杂机制，从而为提高临床疗效提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 肛肠瘙痒洗剂单味药成分和靶点筛选 肛肠瘙痒洗剂的组方为黄柏、马齿苋、苦参、荆芥、浮萍、蝉蜕、防风、地肤子、当归、炙乌蛇。通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）数据[6]，分别获得黄柏、马齿苋、苦参、荆芥、浮萍、蝉蜕、防风、地肤子、当归各单味药化学成分及分子信息，参考已研究文献并通过多次预实验结果，将DL≥0.18和ALogP＜0.5作为ADME性质参数[7]预测以上单味药有效成分的条件。通过中国知网文献及TCMID数据库（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）确定炙乌蛇化学成分，然后使用Swisstarget网站（http://www.swisstargetprediction.ch）进行相关靶点预测，筛选标准为可能性大于0.6[8]。

1.2 湿疹相关基因数据收集 将“eczema”作为关键词，输入Genecard数据库(https://www.genecards.org/,version 4.14)以及OMIM数据库(https://omim.org/)[9]，选择“Homo sapiens”，删除重复基因靶点，得到湿疹相关基因靶点。

1.3 网络构建及核心靶点筛选 通过韦恩图在线工具The Venny online tool (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将肛肠瘙痒洗剂药物对应靶点与湿疹相关靶点整合，获得药物-疾病共有靶点。String数据库包含已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），该数据库收集了大量的蛋白质-蛋白质相互作用关系，涉及总共9 643 763个蛋白质和1 380 838 440个相互作用[10]。将之前获得的114个疾病-药物共同靶基因导入String数据库，选择“Homo sapiens”，获得蛋白质相互作用图。在网络中，节点表示基因、靶标、蛋白质或分子、节点之间的连接表示基因、靶标、蛋白质或分子之间的相互作用。节点的“degree”值表示网络中节点之间的连接数，其中值越大，其成为化合物的关键目标的可能性越大[11]。因此，本研究将连接数值前三十的基因作为关键核心基因做进一步的分析。

1.4 GO及KEGG通路富集分析 使用R软件中的Cluster Profiler软件包对疾病-药物靶基因进行GO和KEGG富集分析，以获得相关功能和途径。筛选标准为FDR＜0.05。

2 结果

2.1 肛肠瘙痒洗剂活性成分及对应靶点筛选 通过TCMSP数据库检索肛肠瘙痒洗剂活性成分，以“DL≥0.18和ALogP＜0.5”作为ADME性质参数预测肛肠瘙痒洗剂有效成分的条件，经筛选后共得到马齿苋有效成分12个，黄柏有效成分55个，荆芥有效成分24个，浮萍有效成分16个，蝉蜕有效成分3个，防风有效成分28个，苦参有效成分62个，地肤子有效成分1个，当归有效成分2个，见表1。根据文献研究以及TCMID数据库得到乌稍蛇化学成分共6种，分别为brachy stemidines A、buty lisobuty l phthalate、dihydroferulic acid、β-sitosterol、thy- mine、4- hy dro xybenzaldehy de、β-sitosterol。根据以上有效成分及筛选条件，在TCMSP数据库中筛选得到药物对应靶点共258个，Swisstarget数据库中筛选得到乌梢蛇相关靶点1个。

2.2 “湿疹”相关疾病靶标以及“疾病-药物”对应靶标筛选 在GeneCards以及OMIM数据库中搜集得到湿疹相关疾病靶点共2 736个靶点。用韦恩图在线工具，筛选得到疾病相关靶标与药物相关靶标共114种，见图1。

图1 疾病和药物靶标的韦恩图

2.3 “疾病-药物”蛋白互作网络建设及重点靶标筛选 使用string数据库，得到“疾病与药物”靶标蛋白互作图。其中，靶点数（number of nodes）为114个，边数（number of edges）为421条，平均相关值（average node degree）为7.39，蛋白互作网络图富集分析P值＜0.001，用cytoscape软件可视化如图2。以“degree”为依据，筛选前30重点基因分别为（图3）：STAT3、EGFR、MAPK14、AKT1、JUN、RELA、MAPK1、STAT1、CXCL8、JAK1、FYN、IL-13、IL-4、ITGB2、IL-10、IL-1B、IL-6、ERBB2、F2、IL-2、MMP2、CASP8、CCR3、ESR1、NR3C1、VEGFA、CCL2、CXCL10、MMP9、NFKBIA。对预测得到的30个靶蛋白进一步分析发现[12-13]：1）调节T细胞增殖及免疫反应重要因子：IL-13、IL-4、IL-10、IL-1B、IL-6、IL-2；2）炎症趋化因 子：CXCL8、CCL2、CXCL10、CCR3；3） 调节炎症中信号转导和转录激活子:STAT3、JAK1、STAT1、NFKBIA、NR3C1、ESR1、RELA ；4）细胞生长和分化信号启动因子：MAPK1、MAPK14；5）调节细胞代谢、增殖和凋亡分子：EGFR、AKT1、VEGFA、CASP8、MMP9、FYN；6）参与炎症细胞黏附和迁移中起重要作用的分子：F2、ITGB2。这些重点靶点提示肛肠瘙痒洗剂可能参与细胞因子介导的炎症细胞信号转导，从而启动一系列效应机制[14]。

图2 蛋白互作网络图

图3 横坐标为靶点degree值，竖坐标为靶点

2.4 肛肠瘙痒洗剂潜在靶标的作用通路注释及分析 预测出的靶标通过R软件中的“Cluster Profiler”安装包及KEGG进行GO及KEGG通路分析。网络分析结果表明，肛肠瘙痒洗剂主要通过细胞因子等生物过程，通过调节IL-17信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、Th1及Th2细胞分化、JAK-STAT信号通路、Th17细胞分化等信号通路来发挥其治疗作用（图4）。

图4 “疾病-药物”靶点GO分析

3 讨论

慢性肛周湿疹患者皮损部位局限于肛周，以皮肤浸润肥厚和瘙痒为主要特点，皮损病机特征为“风湿热”相互夹杂为主要特点，湿重于热，湿性黏着导致皮损的浸润肥厚，风热相搏出现瘙痒不适，日久湿热瘀阻皮肤经络导致皮损蔓延反复。肛肠瘙痒洗剂是在中医理论指导下结合多年临床经验组方而成，属于医院协定方，以燥湿清热，祛风止痒为主，用于风湿热瘀夹杂之肛周皮炎湿疹及肛门瘙痒症。方剂组成以苦参为君，专攻以“湿热风瘀”为主的肛周湿疹局部皮损特征，着重去除湿热，注重湿疹之黏腻重浊；以黄柏、马齿苋为臣药，黄柏能清热燥湿、泻火解毒，在湿疹中应用广泛 ，马齿苋味酸,性寒,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效。两药合用，助君药苦参燥湿清热之效，除肝经湿热；荆芥可解表祛风、透疹止痒，防风祛风解表、除湿止痛，蝉蜕可宣散透发、疏风散热、透疹止痒，浮萍具有祛风止痒之效，四药合均为佐药，着重祛风止痒。慢性湿疹顽固难除，“久病必瘀”，故当归和乌蛇为使药，当归具补血活血、通络止痛之功，乌蛇有祛风通络之功，取当归和乌蛇配合主方使用，取其活血通络之功效，达到“治风先治血，血行风自灭”的目的，助缠绵难愈之慢性湿疹皮损修复。通过分析方中药物的君臣佐使配伍关系，既祛除“风湿热”治病因素，又兼顾慢性肛周湿疹“瘀血阻络”的病理特点，构建了该方燥湿清热，祛风止痒的整体框架。

熏洗坐浴疗法是一种古老的中医外治法，在慢性肛周湿疹的治疗中占据重要位置。将复方制剂熬制后进行肛门局部熏洗坐浴，药液可通过皮肤孔窍、腧穴等部位直接吸收，再通过经络深入腠理、脏腑各部位，乃至全身, 达到疏通经络、调和气血的效果，从而发挥药物效应[15]。同时通过熏洗坐浴疗法还能预防慢性肛周湿疹的复发，安全性高，未增加患者不良反应[16]。鉴于肛肠瘙痒洗剂组方成分的复杂性，通过网络药理学将该复方制剂多成分、多靶点和多途径的复杂作用关系通过网络学科语言呈现出来，探索其活性成分、作用靶点和信号通路，以分子角度探讨中药配伍规律与作用机制之间的关系，为提高临床疗效及安全性提供科学依据[17]。

目前研究认为，皮肤屏障功能障碍、免疫激活及皮肤菌群紊乱是肛周湿疹发生发展的重要机制，Th1/Th2细胞比例失衡是湿疹发生的关键因素[18-19]。在机体免疫应答过程中，T细胞的激活需要双信号。第一信号需T细胞受体（TCR）与抗原呈递细胞（APC）表面的抗原／组织相容性复合物（MHC）结合，T细胞获得信号的强度与抗原和TCR之间的亲和力及抗原剂量有关[20]。第二信号即共刺激信号主要影响T细胞活化方向，影响细胞增殖和凋亡。另外细胞因子介导了另一条非TCR依赖的Th细胞分化调节途径，研究表明IL-12介导Th0细胞向Th1，而IL-4在Th0细胞向Th2分化中发挥重要作用，因此IL-12和IL-4被认为是Th1和Th2的关键启动因子。Th1细胞主要分泌白介素IL-2、IFN-γ、IFN-α，TNF-β等；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13、IL-25和IL-31等。Th1型和Th2型细胞因子之间相互制约，维持皮肤正常免疫平衡，一旦平衡紊乱，被激活的Th2型细胞因子进一步促进炎症反应的级联式放大效应[21]，引起一系列湿疹皮肤炎症反应的发生。

通过网络药理学对肛肠瘙痒洗剂的药效物质基础、分子靶标及作用机制进行相关预测，笔者发现肛肠瘙痒洗剂可能参与细胞因子介导的细胞信号转导从而启动效应，这对揭示肛肠瘙痒洗剂复方成分的效应机制具有重要价值，同时可以与肛肠瘙痒洗剂“燥湿清热，祛风止痒”的中医治疗法则相互印证。该网络拓扑研究结果在一定程度上验证了肛肠瘙痒洗剂治疗肛周湿疹的有效性，为今后进一步深入探讨肛肠瘙痒洗剂的药理作用及相关机制打下基础，对从科学的角度认识中医药发展具有重要意义。接下来将继续完善实验验证部分，通过临床试验进一步评价肛肠瘙痒洗剂治疗慢性肛周湿疹的有效性和安全性，并建立慢性湿疹的动物模型，从组织、细胞、分子水平探索肛肠瘙痒洗剂的作用机制。