冠心通络方通过PI3K/Akt通路延缓氧化应激对糖尿病大鼠 主动脉的影响*

姚灿坤，牟雷，张天奉，唐新征

广州中医药大学深圳医院 广东深圳 518034

近10年来，2型糖尿病引发的以动脉粥样硬化为代表的心血管并发症的发病率在全球范围内不断上升，成为2型糖尿病患者最常见的死因，严重危害了人类健康[1]。流行病学研究发现，超过50%的糖尿病患者最终将死于糖尿病的大血管病变[2]。

糖尿病是心血管系统疾病的独立危险因素，高血糖状态下可刺激氧化应激反应与炎症反应，加快动脉粥样硬化的发生、发展[3]，从而导致糖尿病血管病变，糖尿病血管病变是导致糖尿病致死、致残的主要原因。虽然糖尿病血管病变的发病机制目前还未清楚，但是可以明确的是动脉粥样硬化是糖尿病合并血管病变的病理基础。中医药在糖尿病及动脉粥样硬化预防及治疗上具有副作用少、疗效确切等优势[4-5]，其研究成果已被2017版《中国2型糖尿病防治指南》采用并推荐防治糖尿病及其并发症。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B （PI3K/Akt）信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，通过血管内皮细胞迁移、血管形成、能量代谢等多种机制调控心血管功能，与氧化应激、炎症反应关系密切[6-7]。

冠心通络方为广州中医药大学深圳医院心血管病科的协定处方，临床应用效果良好，无不良反应，是以补阳还五汤为基础方加减而来，动物实验及临床研究均表明具有活血通络的补阳还五汤可以通过降糖、调脂、减轻炎症、改善氧化应激等对糖尿病动脉粥硬化具有一定的防治作用[8-9]。本研究拟通过观察冠心通络方对糖尿病大鼠氧化应激、炎症反应及主动脉组织中PI3K/Akt蛋白表达的影响，试探讨冠心通络方对糖尿病动脉粥样硬化的作用机制。

材料与仪器

1 实验动物

63只雄性SD大鼠（300±20）g，购买于广州中医药大学实验中心，实验动物生产许可证号:SCXK（粤）2013-0034。饲养条件:广州中医药大学第一附属医院SPF级实验室，自由进食饮水，人工照明，明暗交替12h/12h，室温22～24度，相对湿度67%，通风良好。

2 药物与试剂

冠心通络方（黄芪30g，白参10g，麦冬15g，葛根30g，丹参15g，赤芍10g，红花10g，瓜蒌壳30g，地龙10g，甘草5g）由广州中医药大学深圳医院中药房提供。阿托伐他汀钙片钙10mg/片（美国辉瑞制药有限公司，批号H20051408）。链脲佐菌素（STZ），美国Sigma；柠檬酸钠缓冲液，北京雷根生物技术有限公司；PI3K-1小鼠单克隆抗体、Akt-1兔多克隆抗体，英国Ab-cam公司；BCA法蛋白含量检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗，武汉博士德生物工程有限公司；大鼠C反应蛋白试剂盒、白细胞介素6试剂盒，上海华壹生物科技有限公司。

3 方法

3.1 动物造模分组及给药 63只雄性SD大鼠按数字表法随机分为正常对照组11只和造模组52只。正常对照组给予标准普通饲料；造模组采用高糖高脂饲料+灌胃高糖高脂乳+饮用蔗糖水的方法联合喂养6周。7周后若体质量符合实验标准者为食源性肥胖大鼠，在此基础上进行造模，其余淘汰，共有50只大鼠符合食源性肥胖标准。禁食12h后，造模组大鼠一次性小剂量（28mg/kg）腹腔注射STZ，正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲液，各组以原饲料继续喂养。实验第12周后经尾尖端采血测空腹血糖，若空腹血糖≥11.1mmol/L，且有多饮、多尿、多食现象确定为糖尿病模型大鼠，共有45只入组。将入组大鼠随机分为模型组、冠心通络方组和阿托伐他汀钙片组各15只。冠心通络方组大鼠给予冠心通络方溶液17.325g/kg灌胃，阿托伐他汀钙片组大鼠给予阿托伐他汀钙片水溶液1.05mg/kg灌胃。药物干预一共12周。

3.2 一般情况 每天观察大鼠活动及精神状态、毛色、饮食、二便等情况。

3.3 血液采集和标本制备 末次给药后禁食12h，腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，PBS灌注完毕后迅速处死大鼠取出主动脉，冰盐水冲洗后放入10%中性甲醛固定，其余部分组织放入-80℃冰箱中保存。

3.4 血生化指标测定 使用生化分析仪检测空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白；使用ELISA试剂盒检测C-反应蛋白、IL-6；使用生化试剂盒检测丙二醇、超氧化物歧化酶，严格按试剂盒说明书步骤操作。

3.5 Westernblot 分别取主动脉组织50mg 加入0.5ml PIPA裂解液提取组织总蛋白，用BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白浓度。配置SDS聚丙稀酰胺凝胶。每个样品上样20ug，恒流300mA转膜60min，放入5%封闭液中封闭1h，洗膜5min，将膜分别加入一抗PI3K-1（1:1000）和Akt-1（1:1000），4℃ 孵育过夜，洗膜3次，每次10min。再将膜放入相应二抗溶液的自封袋中，摇床上摇动50min，洗膜3次，每次10min。在暗室中用ECL试剂盒发光显影，Geo-Pro软件分析相关条带灰度值。

4 统计学方法

所有数据均用均数±标准差（±s）表示。应用SPSS19.0软件进行统计分析。多组间数据比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 各组大鼠一般状况

正常组大鼠行动活跃，精神状态良好，毛色有光泽，摄食量、饮水量、体质量均正常；模型组、冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组大鼠反应迟钝，精神萎靡不振，毛色暗黄无光泽，摄食量、饮水量明显增多，体质量减轻，符合糖尿病“三多一少”的特征；与模型组相比，冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组大鼠一般状况有一定程度的改善。

2 各组大鼠血糖比较情况

对于血糖的影响，与空白组相比，模型组、冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组，空腹血糖、糖化血红蛋白明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，冠心通络方组的空腹血糖及糖化血红蛋白下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05），而冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组组间相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3 各组大鼠炎症指标比较情况:

对于炎症指标的影响，与空白组相比，模型组、冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组的CRP及IL-6明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比，冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组的CRP及IL-6均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），提示冠心通络方及阿托伐他汀钙片均能改善2型糖尿病大鼠的炎症反应状态。冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组组间相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

4 各组大鼠氧化应激指标比较情况:

对于氧化应激指标的影响，与空白组相比，模型组、冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组的SOD水平明显下降、MDA水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，冠心通络方组、阿托伐他汀钙片组SOD活性明显上升，MDA水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示冠心通络方及阿托伐他汀钙片均能改善2型糖尿病大鼠的氧化应激水平。冠心通络方组及阿托伐他汀钙片组组间相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血糖、氧化应激及炎症指标

5 各组大鼠PI3K/Akt蛋白表达比较情况:

与空白组比较，模型组、冠心通络方组、阿托伐他汀钙片组的主动脉组织中PI3K的表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，冠心通络方组、阿托伐他汀钙片组的主动脉组织中PI3K的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而冠心通络方组与阿托伐他汀钙片组的主动脉组织中PI3K的表达相比无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

与空白组比较，模型组、冠心通络方组、阿托伐他汀钙片组的主动脉组织中Akt的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，冠心通络方组、阿托伐他汀钙片组的主动脉组织中Akt的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而冠心通络方组与阿托伐他汀钙片组的主动脉组织中Akt的表达相比无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠PI3K/Akt指标。

讨论

糖尿病患者长期处于高血糖状态下，会逐渐引起血管壁增厚、管腔变窄、管腔闭塞，甚至导致心血管事件的发生。高血糖环境下会诱发体内氧化应激亢进、抗氧化能力下降，致使活性氧在体内大量蓄积，从而导致组织和细胞损伤，引起小动脉纤维病变、动脉硬化[10]。此外，糖尿病、动脉粥样硬化经研究证实是炎症性疾病[11]，糖尿病患者血管壁存在持续慢性炎症反应，释放多种炎症因子直接损伤血管内皮，引起氧化应激反应。高血糖、氧化应激、炎症反应三者互为影响，加速动脉粥样硬化的进展，共同参与了糖尿病动脉粥样硬化的病理过程。

PI3K/Akt 信号通路是细胞内重要的生存通路之一，参与调控细胞增殖、生长、分化及凋亡等多种生物学过程[12]。PI3K/Akt 信号通路的活化可以促进组织对葡萄糖的摄取，减弱胰岛素抵抗，此外还可以保护血管内皮细胞等[13]。在高糖导致的动脉粥样硬化的发病机理中，Akt起主要作用，Akt是PI3K信号通路下游的重要蛋白，PI3K/Akt 信号通路广泛参与了动脉粥样硬化的形成过程，包括平滑肌细胞增生、炎症细胞聚集等[14]。PI3K/Akt 信号通路在高血糖情况下可受到抑制，从而促进了心肌细胞凋亡，而维持该通路活化，可改善高葡萄糖造成的内皮细胞损伤[15-16]。据此推测PI3K/Akt通路可能通过调控炎症及氧化应激对糖尿病动脉粥样硬化发挥作用。

祖国医学把糖尿病血管病变归属于消渴病的兼证，中医理论认为，糖尿病血管病变在临床上多以胸闷、胸痛为主症，其病机多为本虚标实，本虚是以气阴两虚为主，标实则以络阻血瘀多见，临床调查也发现气阴两虚夹瘀证是糖尿病血管病变的主要证型，所占比例高达80%以上[17]，因此气阴两虚、络阻血瘀是糖尿病血管病变的基本病机、核心病机。治疗原则以益气养阴，活血化瘀为法。动物实验和临床研究都表明以“益气养阴、活血化瘀”的中药复方可以延缓糖尿病动脉粥样硬化的发生、发展，可明显缓解患者临床症状、改善预后、无严重不良反应，对糖尿病血管病变病变具有防治作用[18-19]。

冠心通络方是我院研制已应用于临床多年的中药制剂，根据中医经典名方补阳还五汤化裁而来，用于冠心病心绞痛的治疗，该方以黄芪、白参为君药，重用黄芪大补脾胃之元气，加用白参更加彰显补气益气之功，气行则血行；麦冬、葛根为臣药，养阴增液、生津止渴；丹参、赤芍、地龙、红花、瓜蒌为佐药，活血化瘀、通经活络；甘草为使药，调和诸药。全方标本兼治，补而不滞，化瘀而不伤正，有益气养阴、活血化瘀之功，契合糖尿病血管病变“气阴两虚、络阻血瘀”的病机。在前期的研究中[20]，动物实验已证实冠心通络方可以扩张冠状血管，抑制血小板聚集、粘附，降低主动脉组织MCP-1、PKC-α表达，抑制炎症增殖，减轻血管内膜增生和血管平滑肌增殖等，从而防止血管再狭窄，提示该方对动脉粥样硬化有一定的防治作用。

研究表明糖化血红蛋白每增加1%，发生心血管疾病的相对危险度增加18%，从而提示糖化血红蛋白与糖尿病血管病变密切相关。SOD和MDA是常用反映氧化应激的指标，SOD活性下降会导致氧自由基代谢产物在体内堆积，MDA含量高低则可间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，二者能较为客观的反应体内氧化应激水平。糖尿病血管病变时炎症因子反应活跃，糖尿病患者中CRP水平明显升高，其是糖尿病血管病变的致病因子与预测因子，IL-6能促进其他炎症因子的释放，其水平的变化可以反应动脉壁的受损程度。从本研究中可以看到，经冠心通络方干预12周后，可以明显降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、CRP、IL-6、MDA的水平，提高SOD水平，提示冠心通络方可以降糖，抑制氧化应激损伤，减少炎症反应。冠心通络方中黄芪、白参、葛根、红花、赤芍等经现代药理学研究已经证实具有降糖、清除氧自由基、抗炎等作用。经冠心通络方治疗后，可提高糖尿病大鼠主动脉组织中PI3K/Akt蛋白的表达，从而推测其抑制或延缓2型糖尿病大鼠动脉粥样硬化的机制与提高主动脉组织中PI3K/Akt蛋白的表达相关，从而发挥了降糖、改善氧化应激反应和炎症反应的作用。

不过，本实验的样本量小，且对机制的研究较为表浅，PI3K/Akt通路是多种通路互相交联的枢纽，对该通路的调控机制尚未完全清楚，需要更大样本量的研究进行进一步确认。