基于网络药理学和分子对接探讨丹栀逍遥散治疗失眠障碍的作用机制*

刘毅，李菲，贾跃进，郝世飞

1 山西中医药大学 山西太原 030024 2 山西中医药大学附属医院 山西太原 030024 3 山西省人民医院 山西太原 030012

失眠障碍（Insomnia Disorder，ID）被定义为有足够的睡眠机会和条件下，仍存在持续的入睡困难，维持困难，早醒或睡眠质量差，并导致某种形式的日间功能障碍的睡眠障碍，其患病率约为10%～20%，是最常见的睡眠障碍[1-3]。现代医学证实ID是抑郁症、心血管疾病以及一些癌症的重要危险因素[4-6]，是人们身心健康的潜在威胁。尽管西医对ID治疗有多种药物可供选择，但没有一种药物可被认为是理想药物[7]。其目前临床使用的最广泛药物为苯二氮卓类药物，但存在中枢神经系统抑制、运动失调、记忆损害等副作用，长期应用还可诱发依赖性、成瘾性等问题[8]。因而，探索治疗ID安全有效的药物是当下的重要课题。

丹栀逍遥散出自《内科摘要》，由丹皮、栀子、当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、甘草、生姜、薄荷10味中药组成，具有疏肝健脾，清热养血的功效，常用以治疗肝郁化火证[9-10]。而证候学研究表明肝火证是ID的主要证型，现代药理学研究认为该方成分具有抗抑郁、抗焦虑和神经保护等作用，并且临床研究证实其对ID有确切治疗作用，因此可确定丹栀逍遥散治疗ID安全有效[11-13]。中药复方具有多成分、多靶点、多通路发挥作用的特点，故使用网络药理学的方法可以一定程度揭示其作用机制，为进一步研究提供思路和参考[14]。

资料与方法

1 丹栀逍遥散活性成分与靶点搜集

以丹栀逍遥散中各药物为关键词在TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中分别检索，并限定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，血脑屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3，类药性（drug—likeness，DL）≥0.18，筛选得到其活性成分并匹配靶点，无靶点的活性成分则利用Swisstargetprediction平 台（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测靶点，再将得到的靶点在Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）中匹配基因名。

2 失眠障碍疾病靶点与药物-疾病靶点交集获得

以“insomnia disorder”为关键词分别在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库中检索并搜集疾病靶点，合并去重后得到ID疾病靶点。将所获药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，得出丹栀逍遥散中活性成分直接对ID有作用的靶点，并以Venn图表示。

3 疾病-药物-成分-靶点网络和蛋白互作关系（PPI）网络构建

以疾病、方剂、活性成分、靶点为节点，边为相互关联关系，运用CytoscapeV3.8.0构建疾病-方剂-药物-成分-靶点以及疾病-方剂-成分-交集靶点网络。然后将交集靶点导入String数据库（https://string-db.org/），设置物种为:智人，得到PPI网络，并选择网络中节点度＞二倍中位数者构建核心靶点网络图。

4 GO（Gene Ontology）富 集 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

将交集靶点导入Metascape平台（https://metascape.org/）分别进行GO分子功能、细胞成分、生物过程和KEGG通路富集分析，并利用在线作图平台ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/）将结果可视化。

5 核心成分和核心靶点分子对接验证

分别选取疾病-药物-成分-靶点网络中节点度值＞2倍中位数的核心活性成分和PPI网络中筛选出的核心靶点在ZINC（http://zinc.docking.org/）数据库、PDB（http://www.rcsb.org/）数据库中找到其三维结构，对于没有结构记录的靶点则利用SWISSMODEL平台（https://swissmodel.expasy.org/）模拟构建其三维结构，然后将核心成分和核心靶点结构预处理后使用Autodock vina进行分子对接，并在Pymol中进行可视化。

结果

1 丹栀逍遥散活性成分与靶点搜集结果

通过在TCMSP中限定OB、BBB、DL值，获得牡丹皮活性成分3种，对应靶点4个；栀子活性成分10种，对应靶点139个；当归活性成分2种，对应靶点69个；白芍活性成分3种，对应靶点42个；柴胡活性成分9种，对应靶点85个；茯苓活性成分6种，对应靶点49个；白术活性成分4种，对应靶点78个；甘草活性成分69种，对应靶点1270个；生姜活性成分5种，对应靶点90个；薄荷活性成分3种，对应靶点43个，其中重复成分5种，经合并排除并去重后，丹栀逍遥散共计得到活性成分102种，对应靶点147个，其成分信息见表1。

表1 丹栀逍遥散部分活性成分基本信息

2 ID疾病靶点与药物-疾病交集靶点获取结果

在GeneCards、OMIM、TTD数据库中分别得到2281、673、28个ID靶点，合并去重后，得到ID靶点2916个。将其与所得的147个药物靶点取交集，得到丹栀逍遥散直接对ID作用的52个交集靶点，见图1。

图1 药物-疾病交集靶点

3 疾病-药物-成分-靶点网络和PPI网络构建结果

利用Cytoscape软件构建疾病-方剂-药物-成分-靶点和疾病-方剂-成分-交集靶点网络图，见图2、3，其中蓝色节点表示疾病，绿色节点表示方剂，红色节点为靶点或交集靶点，边为其相互关联关系，图2中共有261个节点，1611条边，各色矩形为各药物，以拼音缩写表示，各色圆形为活性成分，用表1中编号表示；图3中共计145个节点，672条边，以黄色圆形表示各活性成分。综合以上2个网络可得节点度较大（Degree＞二倍中位数）的活性成分有:豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等12个成分，见表2。将52个交集靶点导入String数据库得出以靶点为节点，蛋白互作为边的PPI网络，见图4，得出其节点数为52，边数为234，平均节点度为9，平均局部聚类系数为0.635，再利用Cytoscape分析其节点度，选取节点度＞二倍中位数的靶点为核心靶点构建网络，见图5，其核心靶点为:MAOA、SLC6A4、ACHE、MAOB、CHRNA4、TNF、HTR3A。

图2 疾病-方剂-药物-成分-靶点网络

图3 疾病-药物-成分-交集靶点网络

图4 PPI网络

图5 PPI核心靶点网络

4 GO富集分析和KEGG通路富集分析结果

将交集靶点导入Metascape平台分别进行GO和KEGG通路富集分析，总体GO富集分析获得762条结果，其中GO生物过程、分子功能和细胞成分各得到618、93和51条结果，然后分别筛选其p值＜0.01，最小计数为3，富集因子＞1.5的前20、15和9项结果，绘制富集气泡图，见图6。结果可见，主要生物过程包括:神经递质水平调节、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、对类固醇激素的反应、对外源物刺激的反应、膜电位调节、离子传输调节、细胞分泌调节等；分子功能主要涉及:肾上腺素受体活性、铵离子结合、神经递质受体活性、类固醇激素受体活性、单胺跨膜转运蛋白活性等；细胞成分则主要有:突触膜的组成部分、受体复合体、膜筏、神经细胞体等成分。KEGG通路分析得到61条结果，分别将通路、交集靶点和活性成分作为节点，其相互关系为边构建网络，以更直观看出三者关系，见图7，然后按照和GO分析相同的筛选条件，选择其前12项结果绘制气泡图，见图8，可得主要通路为:神经活性配体-受体相互作用、细胞色素P450介导的药物代谢、血清素能突触、癌症中的蛋白聚糖、催乳素信号通路等，其中神经活性配体-受体相互作用通路基因占比、q值都远高于其他通路，因此可以判断药物最可能藉由该通路发挥作用，图9为其具体作用机制。

图6 GO富集分析气泡

图7 活性成分-通路-靶点网络

图8 KEGG通路富集分析气泡

图9 神经活性配体-受体相互作用通路机制

5 核心成分与核心靶点分子对接结果

核心靶点与成分分子对接结果均＜-5 kcal/mol，见表2，表中标注内容为核心成分的MolID、编号和核心靶点的PDBID，可见核心成分与核心靶点均能形成稳定结构。并分别取与每个核心靶点对接最稳定的核心成分运用Pymol对其构象进行可视化，其中灰色部分为靶点，绿色部分代表关键成分，其余各色标记残基，并显示其名称，黄色虚线为氢键，并标示其距离，见图10。

图10 核心成分与核心靶点分子对接构象

表2 核心活性成分与核心靶点分子对接结果

讨论

ID属于中医“不寐”的范畴，中医对于其有深刻的认识，早在《黄帝内经》时期，就有相关论述:“人之卫气，日行于阳，夜行于阴……日暮在外之阳气将尽，而阴气渐盛，则目瞑而卧。[15]”从生理角度阐述了睡眠的发生机制，睡眠是一个依赖营卫之气推动的节律周期；而相反:“卫气不得入于阴，长留于阳，则阳气满……不得入与阴则阴气虚，故不目瞑。[15]”则从病理角度阐述了失眠的发病机理:营卫运行失常，节律周期紊乱而失眠。因而确立了“营卫失和，阴阳不交”[16]的总病机与“调节律”的治疗总纲。而与营卫之气运行相关性较大的脏腑是肝，气的正常运行依赖于肝主疏泄的功能。肝病则失疏泄，所谓:“郁而不舒，皆肝木之病也”[17]，分为疏泄太过和疏泄不及:疏泄太过，机体处于亢奋状态，易肝郁化火、木旺乘土；疏泄不及，则会造成气机不畅，肝郁较著，产生痰、湿、瘀等病理产物。因此调节律实为调气，调气实为调肝。肝为风木之脏，寄相火而主动，且“气郁皆属火”[18]，故治疗失眠当多从肝火论。

综合本研究所构建的疾病-方剂-药物-成分-靶点和疾病-方剂-成分-交集靶点网络，通过筛选节点度大于二倍中位数的活性成分，可得出丹栀逍遥散核心成分12种，其中成分B在动物实验被证实可使谷胱甘肽、γ-氨基丁酸（GABA）水平上升，多巴胺（DA）、丙二醛、肿瘤坏死因子-α水平以及乙酰胆碱酯酶（AChE）活性下降从而发挥对精神症状的调节作用并可上调神经发生和突触形成基因而改善脑功能[19-20]；A成分可显著增加了小鼠脑中的去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）水平，从而介导抗抑郁活性[21]；GC7、GC8、GC20、GC35、GC49、GC58、GC5、GC46、GC51、GC56等成分均为甘草中的黄酮类物质，研究认为该类物质总体具有抗抑郁和神经保护作用[22]，此外，GC8可通过抑制神经炎症改善认知功能[23]；GC49可以活化小胶质细胞预防多巴胺能神经元丢失[24]。筛选PPI网络中节点度大于二倍中位数的核心靶点，可认为是丹栀逍遥散在ID治疗中的核心靶点，该七个核心靶点中:MAOA、MAOB 在中枢神经系统单胺的代谢中具有重要作用，其活性与睡眠的生物学变化有关[25]；ACHE编码的AChE可快速水解终止胆碱能突触的神经传递，服用其抑制剂可改善睡眠状态[26-27]；CHRNA4编码烟碱乙酰胆碱受体，其可通过控制神经递质的释放和摄取来调控睡眠和觉醒功能[28]；HTR3A编码5-HT受体，SLC6A4则介导5-HT对5-HT能系统受体的调节，5-HT是一种神经递质，其拮抗剂是一种ID的治疗药物[29-31]；TNF编码多功能促炎因子，其被证实会增加非快速眼动睡眠时间并被认为是一种睡眠启动因子[32-33]。

通过GO富集分析得到主要生物过程有神经递质水平调节、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、对类固醇激素的反应等。其中神经递质水平调节是ID最重要的生物过程，现代研究认为睡眠唤醒周期不同阶段的启动和维持是通过多种神经递质调节实现的[34]；已经证实NE的神经传递，尤其是α-肾上腺素能受体功能是人类睡眠-苏醒调节的关键组成部分[35]；丹栀逍遥散所得核心成分多为类固醇类，存在激素样作用，类固醇激素如雌激素和孕酮调控女性一生的睡眠方式变化，皮质醇则发挥促觉醒作用[36]。KEGG通路富集分析得到的主要通路有神经活性配体-受体相互作用、细胞色素P450介导的药物代谢、血清素能突触、催乳素信号通路等。其中根据各项数据可得神经活性配体-受体相互作用是最可能的治疗通路，目前所发现的促进觉醒/抑制睡眠的物质（如:儿茶酚胺，食欲素和组胺）和促进睡眠/抑制觉醒的物质（如:GABA，腺苷，5-HT，褪黑素）几乎都藉由此通路发挥作用；[37]血清素能突触通路则与神经机制密切相关，主要涉及5-HT对睡眠觉醒的调节[38]；细胞色素P450酶对于药物的代谢至关重要，该通路可能涉及丹栀逍遥散中药物的代谢[39]；催乳素是一种肽类激素，报道认为其有促进神经发生、发育，促进睡眠以及神经保护的作用。[40]分子对接结果显示，核心成分和核心靶点均能形成稳定结构，而通过计算结合力的均数，又可得到对接较好的核心成分有:GC35（shinpterocarpin）、GC51（4'-甲氧基光甘草定）、B（豆甾醇）和A（β-谷甾醇），可见这四种成分为丹栀逍遥散中治疗ID发挥作用的关键成分，而这四种成分来自六种中药物，说明丹栀逍遥散中药物可协同发挥作用；核心靶点有:MAOB、MAOA、SLC6A4，可见丹栀逍遥散最可能通过神经系统中的单胺类物质和5-HT发挥作用。

综上所述，通过网络药理学结合分子对接研究，可以初步揭示丹栀逍遥散治疗失眠障碍的关键成分为:shinpterocarpin、4'-甲氧基光甘草定、豆甾醇和β-谷甾醇，作用关键靶点为:MAOB、MAOA、SLC6A4；关键通路为神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触。该结论可为临床应用和进一步研究提供参考，也可为本课题组课题提供思路。