青蒿治疗系统性红斑狼疮的网络药理学分析*

龚晓红，李桓，李松伟，王炳森，姚曼曼

1 河南中医药大学 河南郑州 450046 2 河南中医药大学第一附属医院 河南郑州 450000

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种因免疫功能紊乱、体内出现多种自身抗体的自身免疫性疾病[1]。其发病机制涉及基因、表观遗传、环境及性激素等多种因素，SLE患者体内T淋巴细胞异常活化，同时，B淋巴细胞产生多种自身抗体，导致皮肤、肾脏、浆膜、血液、神经等多系统、多器官受损，临床表现多样[2]。目前主要以糖皮质激素、免疫抑制剂等治疗为主[3]。但也存在副作用多、选择性缺乏等问题。

SLE属于中医学的“阴阳毒”“蝴蝶斑”“日晒疮”等范畴。其证型变化难以捉摸，对SLE中医证型相关文献进行总结，得出以下规律:SLE多热毒炽盛证、阴虚内热证、肝肾阴虚证、气阴两虚证；SLE后期多虚证，呈现阴虚内热证、肝肾阴虚证、气阴两虚证[4]。上海市中医医院研究也显示SLE患者经治疗病情稳定后多向阴虚内热型转化[5]。可见阴虚是SLE发病过程中一个重要因素。

青蒿是菊科植物黄花蒿（Artemisia annuaL.）的干燥地上部分，性寒，味苦、辛，苦寒清热，辛香透散，善使阴分伏热透达外散；归肝、胆经。具有清透虚热，凉血除蒸，解暑截疟等功效，用于治疗暑热外感、夜热早凉、骨蒸劳热、疟疾寒热、湿热黄疸等症，为阴虚发热之要药[6]。大量临床及动物研究[8-14]表明以青蒿鳖甲为主的方药联合常规西药治疗SLE可以起到增效减毒的效果。青蒿素（artemisinin）为青蒿的主要有效成分之一。研究[15-19]表明青蒿素类衍生物青蒿琥酯、双氢青蒿素可改善狼疮小鼠症状及相关指标。但目前对青蒿的主要有效成分治疗SLE的机制研究并不全面，本研究采用网络药理学研究方法，搜集青蒿有效活性成分及作用靶点，对青蒿治疗SLE的作用机制进行全面探讨，为进一步研究青蒿治疗SLE的作用机制提供一定依据。

资料与方法

1 青蒿有效成分、靶基因筛选

TCMSP是基于传统中药系统药理学框架而建立的数据库和可视化平台，包括在中国药典注册的499种中草药，29383种成分，3311种作用靶点和837种相关疾病[20]。在检索框输入“青蒿”，选择“Ingredients”，设置过滤条件:类药性（DL）＞0.18及口服生物利用度（OB）＞30%，筛选出青蒿的有效活性成分。在“Related Targets”栏目获取青蒿所有活性成分的靶基因，通过Perl软件筛选出过滤活性成分所对应靶基因，运用Uniprot数据库将基因名标准化处理。

2 SLE相关基因筛选

人类基因数据库（GeneCards，https://www.genecards.org/）和 （OMIM，http://www.omim.org/）均可自动整合网络资源的基因数据，全面提供有关人类基因注释和预测信息[21-22]。通过在OMIM和GeneCards数据平台搜索关键词“Systemic lupus erythematosus”查找与SLE相关基因。剔除上述数据库中重复和假阳性的基因，用R软件（Version3.6.0）绘制Venny图进行靶点进行映射，得到共同基因，即为青蒿治疗SLE的关键基因。

3 PPI网络图构建

String数据库（https://string-db.org/Version 11.0）是旨在提供蛋白质-蛋白质相互作用的关键评估和整合，包括直接（物理）和间接（功能）关联的一个平台[23]。将药物与SLE的共同基因导入该数据库中，研究的物种限制为人类，选择highest confidence，导出并保存为TSV格式，获得关键基因PPI关系文件，导入Cytoscape软件（Version 3.7.1），以节点的大小和颜色表示度值的大小，节点越大，颜色越深，对应的度值越大；边的粗细表示综合分值，综合分值越高，线条越粗。根据度值，运用R软件筛选出排名前30的核心基因并绘制条形图。

4 核心靶点的生物功能（GO）注释和相关通路（KEGG）分析及可视化

在R软件运行Bioconductor“org.Hs.eg.db”包，将青蒿治疗SLE的关键基因名转换成entrezID，运行“clusterProfiler”包，设定P＜0.05，进行GO和KEGG富集分析，绘制GO条形图和KEGG气泡图进行功能注释。其中，气泡图和条形图中图形颜色越红表示校正后P值（P.adjust）值越小；节点越大、条形越长表示富集的靶基因数量越多。P.adjust值越小并且靶点数量越多说明其显著性就更高，也越重要。

5 “药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络构建

创建“药物-活性成分”、“活性成分-潜在靶点”、“疾病-潜在靶点”相关文件，导入Cytoscape构建“药物-活性成分-潜在靶点-疾病”网络。在网络中，节点（node）分别代表青蒿（qinghao）、活性成分、潜在靶点和SLE。边（edge）代表青蒿与对应活性成分、活性成分与潜在靶点、SLE与潜在靶点相互作用关系。在这整个网络中展示了药物-活性成分-潜在靶点-疾病之间的关系，通过构建该模型更直观地呈现了青蒿治疗SLE的作用机制。

结果

1 青蒿成分和靶基因

在TCMSP数据库检索关键词“青蒿”，以OB＞30%和DL＞0.18进行过滤，得到22个青蒿活性成分。选择“Ingredients”，得到青蒿所有活性成分作用靶点1344个，通过Perl软件筛选活性成分作用靶基点，获得184个青蒿活性成分对应靶基因。见表1。

表1 青蒿活性成分及OB、DL值

2 SLE相关基因

在GeneCards、OMIM两个数据库中输入检索词“systemic lupus erythematosus”，分别得到4060个、63个SLE相关基因，经去重后得到3983个SLE相关基因，与184个青蒿作用靶基因映射，得到111个青蒿活性成分治疗SLE的关键靶点。见图1。

图1

3 核心靶点PPI网络构建

将111个共同靶基因导入 String 数据库，将TSV文件导入Cytoscape 软件绘制蛋白相互作用网络图，见图 2。图中每个节点表示1个基因，边表示2个基因之间的互作关系，共涉及383条边，103个节点。根据节点度值（degree）的大小，获得排名前30的靶基因，见图3。Barplot图显示，AKT1、JUN、RELA、MAPK1、IL6、MAPK14、MAPK8、CXCL8前8个基因排名较前，绘制前8位核心基因与青蒿主要活性成分对应关系，发现除MAPK14外其余7个基因均与主要有效成分相连，此7个基因为核心基因。见图4。

图2

图3

图4

4 “药物-活性成分-关键靶点-疾病”网络

将药物、活性成分、关键作用靶点和疾病关系导入Cytoscape软件中构图，图中红色三角形代表疾病SLE，绿色六边形代表药物青蒿，紫色六边形代表有效活性成分，蓝色长方形代表关键靶基因。从图中可以看出，在青蒿的22个活性成分中，与111个潜在作用靶点相连接的共18个，部分单一成分与多个基因连线，单个基因也与多种成分连接，表明青蒿是通过多成分、多靶点的方式来治疗SLE。见图5。

图5

5 GO功能富集分析

通过R软件运行“Bioconductor cluster Profiler”包对关键靶基因进行GO功能富集，共得到138个生物学过程和功能，对P.adjust进行降序排列，选择前20个用条形图呈现。图中显示青蒿治疗SLE可能主要参与细胞因子受体结合、细胞因子活性、核受体活性、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA结合、血红素结合、四吡咯结合、受体配体活性、类固醇激素受体等功能。见图6。

图6

6 KEGG 通路富集分析

通过R软件运行“Bioconductor“clusterProfiler”包对关键靶基因进行KEGG功能富集，共得到157条通路，对P.adjust进行降序排列，选择前20条通路用气泡图进行呈现。青蒿治疗SLE的靶基因主要富集在TNF、IL-17、Toll样受体、Th17细胞分化及病毒感染、癌症等信号通路。见图7。

图7

讨论

青蒿是我国中医药宝库中的一大瑰宝。清代陈士铎《洞天奥旨》云:“日晒疮，乃夏天酷烈之日曝而成者也……止须消暑热之药，如青蒿一味饮之，外用末药敷之即安”[7]。范永升等通过研究发现SLE患者总以阴虚为本，以热毒、瘀血为标，并以解毒袪瘀滋阴方“干地黄、鳖甲、青蒿……”来治疗SLE，可减少糖皮质激素的用量，提高疗效[24]。从青蒿中提取的有效成分青蒿素以及新型青蒿素衍生物具有显著的免疫抑制活性和治疗的安全性，且动物实验研究表明其具有双向免疫调节作用，对于SLE等自身免疫性疾病有可信的疗效[19、25-27]。以往的研究为本文提供了线索，但尚不全面。随着系统生物学的推广，基于大数据的网络药理学已成为分析复杂成分的中药作用机制的重要方法，本文应用网络药理学的方法对青蒿的有效成分进行筛选，预测治疗SLE的关键靶点和信号通路，为后续青蒿治疗SLE的研究提供一定的依据。

本研究运用现代网络药理学方法，通过检索青蒿的活性成分及潜在靶点、SLE相关靶点，找到青蒿-SLE共同靶点111个，对这些靶点进行GO功能分析及KEGG富集通路分析，预测出青蒿的主要活性成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、青蒿素等，其核心靶点为AKT1、JUN、RELA、MAPK1、IL6、MAPK8、CXCL8基因，通过GO功能和KEGG富集分析，青蒿治疗SLE的靶基因主要参与细胞因子受体结合、细胞因子活性、核受体活性、转录因子活性、受体配体活性、类固醇激素受体等生物功能，主要富集在TNF、IL-17、Toll样受体、Th17细胞分化等信号通路。

主要有效成分槲皮素可通过抑制信号传导及转录激活子1和核转录因子-κB（NF-κB）的激活及丝裂原 活化蛋白激酶家族磷酸化及JAK-STAT等途 径 抑 制IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12 、TNF-α、MMP-9等的生成发挥抗炎免疫作用[27-31]。研究表明[32]槲皮素能降低降植烷诱导的SLE样综合征小鼠模型自身抗体表达水平，对SLE的治疗可能有一定作用。山奈酚能够增加Treg细胞中FOXP3的表达水平，揭示了山奈酚对一系列炎症性疾病预防和治疗的抗炎作用的分子机制[33]。山奈酚还可以抑制小鼠T淋巴细胞体外活化和增殖[34]。木犀草素可通过介导多种炎性信号通路（NF-κB；MAPK和AP-1；JAK-STAT）抑制炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IFN和趋化因子等炎症介质的表达等来调节免疫[35-38]。青蒿素类衍生物目前研究较多。朱卫星等[17]研究发现青蒿琥酯可通过调节SLE小鼠肾脏IL-6和转化生长因子β（TGF-β）表达水平来改善症状。屠呦呦团队通过双氢青蒿素（DHA）治疗狼疮小鼠（BXSB小鼠），发现DHA可抑制其B淋巴细胞增殖，同时促进CD8 + T细胞的增殖抑制自身抗体产生，从而起到双向调节免疫功能[25-26]。新型青蒿素类衍生物马来酸蒿乙醚胺（SM934）通过抑制TLR7/9 mRNA的表达，可减少狼疮小鼠活化的B细胞数量，使浆细胞分泌减少，从而减少IgG和IgM抗体的分泌来缓解症状[39]。

通过构建关键靶基因PPI网络，以及青蒿主要活性成分与核心基因关系，确定AKT1、JUN、RELA、MAPK1、IL6、MAPK8、CXCL8为核心基因。研究[40]发现SLE患者表现出AKT1表达增加，AKT1可激活AKT/mTOR途径，进而通过激活T细胞在SLE的发病机理中起作用。遗传小鼠模型证明，表皮细胞中Jun /AP-1表达的缺失通过转录和转录后途径控制细胞因子的表达，没有JunB表达的组织会导致多器官疾病，其特征是粒细胞集落刺激因子和IL-6水平升高，可能参与SLE发病[41]。RELA（p65）是NF-κB家族成员，研究发现通过下调细胞核中p65水平，抑制NF-κB途径可保护原始诱导的SLE小鼠的肾脏损伤[42]。MAPK1、MAPK8是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员。MAPK级联是将细胞外信号传递到细胞质中以启动细胞增殖，分化和发育等细胞过程的重要途径。MAPK家族包括细胞外信号调节激酶（ERK1/2），c-Jun NH2末端激酶（JNK-1/ 2/3），p38 MAPK。研究发现，SLE患者的骨髓间充质干细胞中JNK磷酸化增加，MAPK通路处于激活状态[43]。IL-6不仅可促B淋巴细胞抗体产生，而且在Th细胞增殖、分化过程中起参与作用，致使大量炎症递质释放，加重炎性反应，进一步加重相关系统、器官损伤。研究显示，血清IL-6水平在红斑狼疮患者中均呈较高表达，且活动期红斑狼疮患者水平明显升高[44]。CXCL8/IL-18是趋化因子CXC家族成员之一，通过与其受体结合后趋化中性粒细胞，而SLE患者中性粒细胞浸润参与组织的损伤。研究显示在活动性SLE发病过程中IL-18显著升高[45]。

Th17是由Th0细胞在IL-6和IL-23等因子的刺激下分化而成。它分泌的最重要的效应因子是IL-17，其受体在体内广泛表达，二者受体结合后介导信号传递引发相应生物学效应[46-47]。研究发现SLE发病过程中，通过Th17细胞分化和IL-17信号通路产生的IL-17可诱导多种细胞产生细胞因子和趋化因子，募集中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润靶器官并造成靶器官损害[48]。Toll样受体信号通路中的Toll样受体（TLRs）广泛分布于免疫细胞以及上皮细胞表面，通过激活NF-κB、MAPK p38和JNK等，介导下游的信号转导，诱导免疫相关基因的表达[49]。Guo Y等研究发现SLE患者的TLR7/9表达水平显著增加[50]。TNF信号转导通路及其调控的上、下游靶点在SLE的发病过程中扮演着极其重要的角色，通过调节NF-κB的磷酸化激活过程，丝裂原活化蛋白激酶及c-Jun基末端激酶通路激活，使多种细胞因子（如IL-1、IL-17等）募集、趋化作用增强，介导炎症、免疫反应及细胞凋亡与增殖过程[51-54]。

本工作为研究中药青蒿在治疗SLE的药效机制方面提供了初步的预测，但其确切的作用机制仍需要后续的实验研究来进一步验证。