基于网络药理学探讨四逆汤防治阿霉素心脏毒性机制

盘冰洁，陆彩虹，谢巍，林彩霞，肖萍

（柳州市妇幼保健院，广西科技大学附属妇产，儿童医院，广西 柳州 545001）

0 引言

阿霉素（doxorubicin）是一种强效、广谱的抗肿瘤药，广泛用于各种实体瘤和血液恶性肿瘤，但因其具有心脏毒性的副作用，使其在临床上的应用受到限制[1,2]。阿霉素引起心脏毒性的机制相当复杂，如氧化应激损伤[3]、细胞自噬[4]、细胞凋亡[5]等，因此使用单一作用靶点的心脏保护剂（如B受体阻断剂、钙通道阻断剂）并没有取得很好的保护心脏作用。中药具有多成分、多靶点、系统调控的优势，在防治阿霉素引起的心脏毒性中取得一定的临床疗效[6,7]。

四逆汤是张仲景《伤寒论》中经典的回阳救逆方，由附子、生姜和甘草组成，在心血管疾病、抗休克、抗肿瘤等疾病均有疗效。近年来研究发现，四逆汤在防治阿霉素心脏毒性中取得较好的疗效[8-10]，但具体机制尚未阐明。网络药理学是运用计算机技术构建药物-疾病-靶点网络关系，实现阐明中药多成分、多靶点、多通路的分析[11]。因此，本文应用网络药理学方法，以探讨四逆汤防治阿霉素心脏毒性的药理学机制。首先收集四逆汤的有效成分并预测作用靶点，并收集阿霉素心脏毒性的靶点；然后取两者的共同靶点进行互作关系分析，以获取关键靶标；最后对共同靶点进行基因本体和通路富集分析，筛选出药物作用的生物学过程、分子功能、细胞组分以及信号通路，阐明四逆汤防治阿霉素心脏毒性的机制，为进一步研究提供线索，具体研究流程见图1。

图1 研究流程图

1 资料与方法

1.1 四逆汤有效成分的筛选及靶点的预测

利用中药系统药理学数据库（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）收集四逆汤中附子、甘草、生姜的化学成分，设定参数口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性指数（drug-like index，DL）≥0.18筛选出四逆汤的有效成分。

1.2 四逆汤作用靶点和阿霉素心脏毒性靶点的收集

利用TCMSP平台检索四逆汤有效成分的潜在靶点。通过蛋白质数据库( Uniprot Database，https://www.uniprot.org/)筛选出物种为“人”的靶点，剔除重复后获得四逆汤有效成分的靶点蛋白信息。

运 用Genecards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://www.omim.org/）数 据 库，以“doxorubicin-induced cardiotoxicity”或“adriamycin-induced cardiotoxicity”为关键词，收集阿霉素心脏毒性的靶点信息。

将四逆汤有效成分对应的靶点与阿霉素心脏毒性的靶点上传至Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmL）得到共同靶点，即四逆汤防治阿霉素心脏毒性的预测靶点。

1.3 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

将收集的四逆汤有效成分及共同靶点输入Cytoscape 3.7.1 软件中，构建四逆汤治疗阿霉素心脏毒性的“药物-成分-靶点-疾病”网络图。网络图中的点代表药物成分或者靶点，边代表药物成分和靶点之间的相互作用。

1.4 靶点相互作用网络的构建

将共同靶点导入STRING（http://string-db.org）平台，选择物种为“人”，获得靶点相互作用网络图（PPI），并通过Cytoscape 3.7.1 软件进行网络分析，获取度值为前20 的Hub 蛋白。

1.5 靶点GO富集和KEGG富集分析

采用David数据库( https://david.ncifcrf.gov/)对靶点蛋白进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，以错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05作为筛选条件，获得四逆汤治疗阿霉素心脏毒性的GO富集和KEGG富集结果，并通过R软件对结果可视化。

2 结果

2.1 四逆汤有效成分及靶点筛选结果

根据OB≥30%，DL≥0.18筛选出四逆汤中附子的有效成分21个，对应靶点56个，其中有15个化合物未找到对应的靶点；甘草的有效成分92个，对应靶点238个，其中有4个化合物未找到对应的靶点；生姜的有效成分5个，对应靶点20个，其中有1个化合物未找到对应的靶点。通过 Uniprot蛋白质数据库筛选出物种为“人”的靶点，剔除重复后共得四逆汤有效成分118个，靶点243个。

表1 四逆汤中成分和靶点

2.2 四逆汤防治阿霉素心脏毒性药物-成分-靶点-疾病网络

通过Genecards和OMIM数据库共收集阿霉素致心脏毒性的靶标128个，将阿霉素心脏毒性的靶点与四逆汤的靶点进行比对，得共同靶点41个，见图2。将41个共同靶点与四逆汤有效靶点比对，发现118个有效成分中有90个成分成功比对，说明四逆汤中28个有效成分没有发挥保护阿霉素心脏毒性的作用。

将数据导入Cytoscape 3.7.1 软件构建四逆汤治疗阿霉素心脏毒性“药物—成分—靶点—疾病”网络图，见图3。图中不同颜色代表不同的节点，黄色代表四逆汤，蓝色代表四逆汤中的有效成分，紫色代表阿霉素心脏毒性，绿色代表共同靶点。由图可知，四逆汤治疗阿霉素心脏毒性呈现多成分、多靶点的特征。

图2 药物和疾病靶点韦恩图

图3 “药物—成分—靶点—疾病”网络图

2.3 蛋白相互作用关系分析

将四逆汤防治阿霉素心脏毒性的41个共同靶点上传至STRING 平台，得各靶点之间的互作关系网络图，各靶点之间均存在相互作用，无游离靶点，见图4。通过Cytoscape 软件中的Cytohubba 插件获取度值为前20的Hub蛋白，见图5。

图4 蛋白互作关系图

图5 四逆汤防治阿霉素心脏毒性的关键靶点

2.4 四逆汤治疗阿霉素心脏毒性基因本体（GO）富集分析

为阐明四逆汤防治阿霉素心脏毒性靶点参与的生命过程，使用 DAVID 数据库对41个共同靶点进行生物学过程（biological process，BP）、分 子 功 能（molecular function，MF）以及细胞组分（cellular component，CC） 富集分析，设置筛选条件为错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05，共富集140个BP，10个CC和5个MF，部分生物学过程及细胞组分、分子功能，见图6。由此可见，四逆汤治疗阿霉素心脏毒性主要参与生物学过程为调节细胞凋亡、细胞程序性死亡、对非生物刺激的反应、对有机物和无机物的反应等多个过程；细胞组分包括细胞质、生物膜内环境、膜筏、细胞器腔等；分子功能包括蛋白质二聚化活性、酶结合、识别蛋白结合、抗氧化活性等多种功能。由此可以推测，四逆汤防治阿霉素心脏毒性是由多途径协同作用。

图6 GO富集分析

2.5 四逆汤治疗阿霉素心脏毒性KEGG 通路富集分析

为进一步揭示四逆汤防治阿霉素心脏毒性的潜在作用机制，对41个共同靶点进行KEGG富集分析，依据FDR＜0.05共筛选得17条相关通路，见图7。结果显示多条通路，包括癌症通路、胰腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、非小细胞肺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、VEGF信号通路、 黏着斑、小细胞肺癌、ErbB信号通路、细胞凋亡、MAPK信号通路、神经营养因子信号通路。提示四逆汤通过以上多条通路来发挥防治阿霉素心脏毒性的作用。

图7 GO富集分析

3 讨论

鉴于阿霉素具有强大的抗肿瘤作用，越来越多的研究寻求减轻心脏毒性的方法，例如通过改变阿霉素的结构或制成脂质体制剂或者使用心脏保护剂[12](Octavia, Tocchetti et al.2012)，然而只有少部分制剂能进入临床试验，而最终能临床使用则少之又少。中药复方按照“君臣佐使”的原则配伍多种草药或矿物，可以达到增效的目的，因此越来越得到研究者的青睐，例如参麦注射液、参芪扶正注射液、参附注射液、生脉注射液、炙甘草汤、生脉饮、四逆汤、益气活血方、参芪注射液、复方苦参注射液等[13]。四逆汤具有回阳救逆功效，主治心肾阳衰寒厥证。研究证实，四逆汤具有强心利尿、抗休克、增加血流量的作用，可抵抗阿霉素心脏毒性引起的心输出量不足、水钠潴留等[14]。研究采用网络药理学方法研究四逆汤防治阿霉素心脏毒性的机制，有助于更好使用本处方。

四逆汤由附子、生姜、甘草三味药组成。现代药理学研究表明，附子具有心肌保护的作用，其总生物碱可以调节缺血心肌能量代谢、细胞修复和抗氧化自由基等相关蛋白的表达[15]；干姜具有改善局部血液循环的作用，通过环氧合酶、脂氧合酶促进血管收缩反应[16]；甘草具有抗氧化、保护心肌细胞的作用，通过调控清除自由基、调节血脂相关蛋白而保护心血管系统[17]，说明四逆汤具有多重靶点的作用机制。本研究共发现四逆汤在防治阿霉素心脏毒性中发挥作用的有效成分90个、靶点41个，证实了中药的多成分、多作用靶点机制。

关于四逆汤调控阿霉素心脏毒性的具体机制，研究表明其通过调控Bcl2、caspase3、caspase9、SOD、MAPK相关蛋白而发挥抑制细胞凋亡、过氧化等机制相关[18-21]。我们研究发现，四逆汤调控Bcl2、BAX、caspase3、caspase9、SOD、MAPK等蛋白表达，且Capase3、MAPK是关键基因，GO富集分析发现主要生物学过程主要富集与细胞凋亡、对刺激的反应等，与研究报道中的凋亡和过氧化反应一致。阿霉素心脏毒性是一种剂量、时间相关的毒性反应，通过氧化应激、细胞凋亡、钙功能障碍、拓扑异构酶II 、线粒体功能受损等机制使心肌细胞受损[5,22]。阿霉素通过活化caspase和降解核小体DNA导致了血管内皮细胞和心肌细胞的凋亡[23]， MAPK信号通路是通过氧化应激触发细胞凋亡的主要中间体[24]。本研究GO富集显示四逆汤主要通过凋亡信号通路发挥保护阿霉素心脏毒性的作用，KEGG富集分析显示主要涉及的信号通路有caspase和MAPK信号通路，与现有的文献报道相似。除此之外，排名前10的生物学过程中，与细胞凋亡相关的有7个，我们推测四逆汤在防治阿霉素心脏毒性主要通过调控细胞凋亡通路。

综上所述, 本文运用网络药理学的方法提示四逆汤防治阿霉素心脏毒性涉及多种蛋白功能、多种通路和生物进程，体现四逆汤多成分-多靶点-多途径缓解阿霉素造成的心脏毒性。但是，四逆汤中20个有效成分未在数据库中找到对应的靶点，后期我们将结合多个数据库进一步补充，同时需要实验进一步验证。