miR-34 与survivin 基因在人结肠癌组织中的表达及意义

王红芳 余细球 叶静 范昭

微小核糖核酸(miRNA)是一类高度保守的非编码小分子核糖核酸(RNA),可以特异性结合靶细胞mRNA,调控靶基因的蛋白表达,参与肿瘤的发生发展［1,2］。其中miR-34 在很多肿瘤细胞系中表达缺失,从而导致细胞增殖、抗凋亡和转移相关基因的表达增加,具有抑癌基因作用,如B 细胞淋巴瘤-2(bcl-2)、白细胞分化抗原44(cd44)、Noch1 等［3］。survivin 作为凋亡抑制蛋白,是miR-34a 的靶基因之一,在细胞增殖和凋亡平衡中发挥重要调控作用。本研究通过荧光定量PCR 技术,检测miR-34 和survivin 基因在人结肠癌组织和癌旁组织中的表达情况,探讨二者与结肠癌发生、发展的关系及作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 临床资料和标本取自2015 年1 月～2017 年12 月深圳市罗湖区人民医院和深圳市北大深圳医院32 例患者手术切除的新鲜组织,其中32 份结肠癌组织(腺癌)标本作为癌症组,32 份癌旁组织标本(据切缘＞2 cm)作为癌旁组,均经病理组织学证实,且在-80℃条件下速冻保存。其中男20 例,女12 例；年龄41～73 岁,平均年龄(59.2±6.1)岁。所有标本收集均得到医院伦理委员会批准,获得患者知情同意并签字。

1.2方法

1.2.1总RNA 提取和miRNA 反转录 50 mg 组织剪碎后,按照Trizol(Invitrogen) 说明书提取总RNA,用分光光度仪检测提取总RNA 含量和纯度,抽提的RNA A260/A280为1.7～2.0。取 总RNA 1 μg,用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR 试剂盒(TaKaRa)进行反转录：2×miRNA Reaction Buffer Mix 5 μl,0.1%BSA 1 μl,miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl,用水补至10 μl,反应条件：37℃ 60 min,85℃ 5 s。反应结束后,用不含RNA 酶的水稀释体系至50 μl,取1 μl 进一步做荧光定量 PCR。

1.2.2荧光定量PCR 分析引物均由上海生物工程有限公司合成,miR-34a 引物序列：tggcagtgtcttagctggttg ；miR-34b/c 引物序列：caatcactaactccactgccat；survivin 引物上游序列：cacctgaaagcttcctcgac,下游序列：tctaacctgccattggaacc；U6 引物上游序列：ctcgcttcggcagcaca,下游序列：aacgcttcacg aatttgcgt。

反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl,上下游引物各1 μl(10 μM),cDNA 1 μl,用水补至20 μl 体系。每个样本3 个复孔,以U6 作为内参,同时每个基因设立阴性对照。扩增条件：95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,40 个循环后95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。

1.3观察指标及判定标准 比较miR-34 和survivin基因在癌症组和癌旁组中的转录表达水平。基因表达相对量采用癌症组/癌旁组=2-△△CT进行计算,其中△△CT=△CT癌症组(CT目的基因-CT内参)平均值-△CT癌旁组(CT目的基因-CT内参)平均值。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验；相关性检验采用Pearson 相关分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

miR-34a 和miR-34b/c 基因表达在癌症组组织中均低于癌旁组,差异有统计学意义(P＜0.05)；在癌症组组织中miR-34b/c 表达较miR-34a 水平降低更显著,survivin 表达增加较癌旁组增高,差异有统计学意义(P＜0.05)；miR-34a 和miR-34b/c 与survivin 在结肠癌癌组织中表达水平呈显著负相关(r=-0.43、-0.51,P＜0.05)。见表1。

表1 miR-34a、miR-34b/c 和survivin 表达水平(,%)

表1 miR-34a、miR-34b/c 和survivin 表达水平(,%)

注：与癌旁组比较,aP＜0.05；与癌症组survivin 比较,bP＜0.05

3 讨论

miR-34 可以抑制细胞生长,调节细胞周期,促进细胞衰老,诱导细胞凋亡,阻止细胞迁移等,被认为是抑癌基因,其家族包括miR-34a、miR-34b 和miR-34c,在不同的物种中均具有高度的保守性。人miR-34a 基因定位于染色体1p36.22,miR-34b 和miR-34c定位于染色体11q23.1,由同一初始转录子所编码。研究发现,miR-34 的调控基因均位于基因组脆性位点区域,在肿瘤中这些区域染色体常发生扩增、缺失或重排,易造成基因表达的改变,从而促进多种疾病的发生,与许多恶性肿瘤的形成相关［3-5］。

随着对miR-34 家族的研究深入,利用其可以调节多种蛋白抑制肿瘤生长这一生物学特点,已有研究把miR-34 家族作为治疗恶性肿瘤的靶点［6］,而导入miR-34 类似物或其前体补充缺失的miR-34 功能,在体内外均可以抑制肿瘤细胞的生长,诱导其凋亡,且对正常组织和细胞没有明显的毒副作用,所以认为miR-34可作为恶性肿瘤的治疗靶点,有极佳的应用前景［7,8］。但miR-34 在人结肠癌组织中的表达、调节和预后等缺乏系统研究,观点也不尽相同。

研究发现miR-34 和结肠癌干细胞之间有联系,miR-34 的丢失会引起结肠癌干细胞/祖细胞增多,导致癌细胞侵袭性发展［9］。在Wan 等［10］研究中,片仔癀可以通过上调miR-34c-5p 的表达来抑制结肠癌HCT-8 细胞增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1 和S 期之间。与正常结肠黏膜组织相比,miR-34a 和miR-34b/c在结肠癌组织标本中表达下调；在结肠癌细胞系中表达缺失,这些与其启动子区超甲基化有关［11］。这些研究都支持miR-34 作为抑癌基因在结肠癌中发挥作用。而Mudduluru 等［12］和Hiyoshi 等［13］的研究观点相反,认为miR-34 在结肠癌中可能是癌基因。Hiyoshi 等［13］用定量RT-PCR 技术对159 例美国和113 例中国结肠癌和癌旁正常组织进行检测,发现所有miR-34 家族成员在结肠肿瘤中表达均明显增加；运用激光显微切割技术,进一步发现miR-34b/c 在肿瘤间质组织中表达增加更显著,该结果与结肠癌预后不良有关,推测miR-34 可能作为癌基因参与结肠癌进展。在本研究中,miR-34a 和miR-34b/c 在癌症组中表达水平分别是癌旁组的56%和49%,均低于癌旁组,尤其miR-34b/c 更明显,差异有统计学意义(P＜0.05),支持miR-34 家族在结肠癌组织中作为抑癌基因发挥作用。

survivin 基因是凋亡抑制蛋白基因家族中非常重要的一员,在大多数恶性肿瘤中都有表达,主要功能为促进肿瘤细胞增殖,抑制凋亡,维系二者之间的平衡。有研究显示survivin 基因是miR-34a 作用的靶基因之一。在喉鳞状细胞癌Hep2 中,miR-34a 过表达可以引起Hep2 细胞活力下降,凋亡增加,细胞迁徙和侵袭力降低；survivin 和Ki-67 基因表达水平也相应下调,认为miR-34a 在喉鳞状细胞癌中是一个负性的miRNA,通过抑制survivin 和Ki-67 基因表达,抑制增殖和浸润转移,并诱导细胞凋亡［14］。在人膀胱移行细胞癌细胞(T24)中,miR-34a 表达量明显低于正常人膀胱上皮细胞,稳定转染miR-34a 类似物后,随着T24 细胞中miR-34a 表达上升,Survivin 蛋白的表达明显降低,细胞增殖、迁移和侵袭能力也显著降低［15］。以上研究均支持miR-34a 通过抑制其靶基因survivin 调节细胞的生物学行为。

相关研究在人结肠癌组织中尚未见报道。在本研究中,miR-34a 和miR-34b/c 基因表达在癌症组组织中均低于癌旁组,差异有统计学意义(P＜0.05)；在癌症组组织中miR-34b/c 表达较miR-34a 水平降低更显著,survivin 表达增加较癌旁组增高,差异有统计学意义(P＜0.05)；miR-34a 和miR-34b/c 与survivin 在结肠癌癌组织中表达水平呈显著负相关(P＜0.05),与前面研究一致。

综上所述,miR-34 家族在结肠癌中作为抑癌基因发挥作用,可以负性调节survivin 的表达,可以做为临床诊治结肠癌的的新靶点。