黑麦多酚对泥鳅冰温贮藏过程中肌原纤维蛋白功能特性的影响

郭利芳，吴肖淮，颜 燕，沈振国

(海南职业技术学院，海南海口570216)

泥鳅是一种形体小而细长的淡水经济型鱼类，其富含蛋白质、脂肪、矿物质和维生素，营养价值较高，在我国食用历史悠久［1－2］。传统水养鲜活方式进行运输和销售泥鳅的方式不符合现代社会对食品卫生、环保及贮运物流的要求，而集中宰杀后通过冷链供应必然会成为今后主要销售模式，因此贮藏过程中品质的保持尤为重要。冰温贮藏通过有效地抑制细菌繁殖、延缓脂肪氧化、降低汁液流失，能较好地保持鱼类的鲜度［3－5］。植物源多酚具有安全可靠、抑菌、抗氧化等活性。窦川林等［6］研究发现－2.5℃贮藏时，3 g/L茶多酚处理可以较好地保持聚氯乙烯保鲜膜包装的泥鳅肌原纤维蛋白的功能特性。丁景等［7］发现抗氧化剂能够显著抑制微冻贮藏泥鳅肌原纤维蛋白的氧化而维持肌原纤维蛋白的功能，其中丁香提取物、植酸与BHT具有较好的效果。冰温贮藏可以较好地保持肉制品的品质，有关冰温保鲜肉制品的报道较多，有关黑麦多酚贮藏保鲜肉制品的报道也较多［8－9］，而鲜见有关黑麦多酚处理泥鳅冰温贮藏的报道，因而本研究对黑麦多酚处理泥鳅在冰温贮藏条件下肌原纤维蛋白功能特性的影响进行研究，为泥鳅的生物保鲜和深加工、烹饪所用原料提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海南泥鳅:体态完好，体型均匀，平均体量50 g左右，体长(9.0±2.5)cm 购于海口海波市场;黑麦，盐酸胍、磷酸盐、溴酚蓝、盐酸(均为分析纯)北京索莱宝科技有限公司;Tris－HCl、十二烷基磺酸钠(SDS)、5，5＇－二硫代双(2－硝基苯甲酸)(DTNB)、2，4－二硝基苯肼(DNPH)(均为分析纯)美国Sigma公司。

ST2100p H计 上海梅特勒－托利多仪器有限公司;FA25高速剪切乳化分散机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司;Thermo冷冻离心机 美国Thermo有限公司;HPP－9272电热恒温培养箱 北京东联哈尔仪器制造有限公司;FA2004电子分析天平 上海华岩仪器设备有限公司;DW－25W518型冰箱 青岛海尔电器有限公司;722－P型可见分光光度计 上海现科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理及贮藏实验 黑麦多酚提取参考文献［8－9］的方法进行，粗提物中每克多酚含量为52.1 mg没食子酸当量。泥鳅宰杀后去内脏，清洗沥水后剪成5 cm×3 cm×1 cm片状，分成4份，3份在无菌蒸馏水配制的1.5、3.0、4.5 g/L黑麦多酚溶液中浸泡，另外1份在无菌蒸馏水中浸泡，然后各处理组放置在灭菌的硬塑托盘中，4℃静置30 min，待表面水分晾干后，保鲜膜封口，速冻至－0.7℃并在此温度下贮藏(前体实验测定泥鳅的冰点温度为－0.7℃)，在贮藏第0、5、10、15、20、25、30 d时提取肌原纤维蛋白并测定其基本理化特性指标。

1.2.2 肌原纤维蛋白的提取 参考文献［10－11］的方法，取一定贮藏期泥鳅净肉样品，加入5倍体积的20 mmol/L、p H7.5的冰冷磷酸盐缓冲溶液，高速匀浆50 s，纱布过滤后取滤液，然后在4℃下10000 r/min离心10 min，获得的沉淀物中加入4倍体积0.1 mol/L KCl缓冲液(pH7.0，含有20 mmol/L Tris－HCl)悬浮后高速匀浆30 s，再4℃下10000 r/min离心10 min，重复2次悬浮、匀浆、离心过程，所得沉淀即为MP，4℃下保存备用。

1.2.3 肌原纤维蛋白功能特性的测定

1.2.3.1 溶解性的测定 参考周茹等［12］的方法略作修改，称取0.1 g的MP，加入40 mL 50 mmol/L Na2HPO4缓冲液(pH6.25，含有0.6 mol/L NaCl)，匀浆30 s，混合均匀后于4℃静置1 h，然后4℃离心(5000 r/min、10 min)，上清液用双缩脲法测定蛋白质质量浓度，采用下式计算溶解度。

溶解度(%)=离心后上清液中蛋白质量浓度(mg/mL)/离心前溶液中蛋白质量浓度(mg/mL)×100

1.2.3.2 表面疏水性的测定 参照Chin等［10］的方法并略作修改，用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.0)将MP配制成5 mg/mL的溶液，取1 mL配制好的样液并加入200μL溴酚蓝(1 mg/mL)，室温下充分混合10 min，离心(8000 r/min，10 min)取上清液稀释10倍，595 nm处测吸光值(A样品)，以磷酸盐缓冲液作为空白对照A对照。肌原纤维蛋白表面疏水性用肌原纤维蛋白结合溴酚蓝的质量来表示。按照下式计算肌原纤维蛋白表面疏水性。

1.2.3.3 羰基、巯基含量的测定 羰基含量的测定采用2，4－二硝基苯肼(DNPH)法，参照Oliver等［13］的方法并略加修改。配制25 mg/mL的MP溶液，吸取两份配制好的溶液分别加入2，4－二硝基苯肼(DNPH)和盐酸，以6 mol/L盐酸胍调零，280 nm处测定加入盐酸后样品的吸光度，再以加入盐酸的样品调零，370 nm处测定加入DNPH后样品的吸光度。羰基含量的计算按下式进行。

式中:A370:370 nm波长下的吸光度;2.2×104L·mol－1·cm－1:摩尔吸光系数;106:mmol/mg到nmol/mg的单位转换系数;C:用6 mol/L盐酸胍做空白调零后，280 nm下测得的蛋白质质量浓度(mg/mL)。

总巯基含量参照刘琴等［14－15］的方法进行测定。取配制好的5 mg/mL的MP溶液1 mL，加入9 mL Tris－甘氨酸溶液，室温下匀浆30 s，离心除去不溶性蛋白，取上清液4 mL，加入0.4 mL 0.01 mol/L DTNB和0.05 mol/L醋酸钠的混合溶液，在40℃下保温30 min，412 nm处测定吸光度值，空白对照用不加蛋白溶液代替。计算公式如下:

式中:13600:巯基浓度计算使用摩尔消光系数L·mol－1·cm－1，A:样品在412 nm处测得的吸光度值，C:样品的蛋白质浓度，mg/mL。

1.2.3.4 乳化性和乳化稳定性的测定 MP的乳化性和乳化稳定性参考文献［16－17］的方法采用浊度法进行测定。将MP用0.1 mol/L的磷酸缓冲液(4℃，pH6.5)配制成质量浓度为1 mg/mL的蛋白溶液，取配制好的蛋白溶液20 mL，加入5 mL大豆油，10000 r/min匀浆1 min，立即从距管底5 mm处吸取50μL乳浊液，然后加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，振荡均匀，静置0、10 min后于500 nm处测其吸光值。分别记为A0、A10，空白用0.1%SDS溶液代替。

乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)计算分别用下式计算:

式中:A0、A10为乳浊液在0、10 min时吸光度值;φ为油相体积分数，%;ρ表示蛋白质量浓度，g/mL;稀释倍数为101。

1.3 数据处理

每个处理重复3次，结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 10.0中的ANOVA进行显著性分析，P＜0.05表示两样本具有显著差异。采用SigmaPlot 14.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对泥鳅贮藏过程中MP溶解性的影响

不同处理泥鳅贮藏过程中MP溶解性如图1所示，从中可以看出所有处理组MP的溶解性都随着贮藏时间的延长而不断下降，其中对照组由贮藏0 d时的65.6%下降到贮藏30 d时的20.6%，而经过黑麦多酚处理后样品下降的程度都低于对照，15、30、45 g/L处理组分别由67.2%、65.9%和68.3%下降到25.6%、27.4%和28.1%，在贮藏20 d后各处理组MP的溶解性都显著高于对照(P＜0.05)，4.5 g/L处理组的效果更好，与文献报道的3 g/L茶多酚抑制了泥鳅肌原纤维蛋白的氧化变性，从而使其具有较好的溶解性，BHT与植酸处理后泥鳅肌原纤维蛋白的溶解性好于丁香、油菜粉以及VE处理的结果类似［6－7］。贮藏过程中泥鳅MP的溶解性下降主要是由于蛋白质被氧化结构发生改变，疏水基团外露，导致蛋白空间构象发生变化，从而形成不溶性的蛋白质聚集体，导致原有蛋白质与结合水的状态被破坏，这是肌原纤维蛋白溶解性不断下降的重要原因［18］。另外随着贮藏时间的延长，羰基含量的增加和巯基含量的下降，导致二硫键形成，进一步促进了蛋白质溶解性的下降［19］。黑麦多酚具有较强的抗氧化活性，一定程度上抑制了蛋白质的氧化，从而保证了泥鳅MP的溶解性，为保持泥鳅MP乳化性、凝胶性等其他功能特性提供了保障。

图1 黑麦多酚处理对泥鳅肌原纤维蛋白溶解性的影响Fig.1 Effects of rye polyphenols on the solubility of loach MP during storage

2.2 不同处理对泥鳅贮藏过程中MP表面疏水性的影响

不同处理泥鳅贮藏过程中MP表面疏水性变化如图2所示，从中可以看出各处理组MP的表面疏水性都随着贮藏时间的延长而不断增加，对照组和各处理组泥鳅肌原纤维蛋白与溴酚蓝结合量贮藏0 d时分别为13.71、12.82、13.21和12.74μg，而30 d时分别达到了51.13、45.14、43.72和41.21μg。在整个贮藏过程中，黑麦多酚处理组泥鳅MP与溴酚蓝结合量均显著低于对照组(P＜0.05)，且黑麦多酚浓度越大，泥鳅MP与溴酚蓝的结合量越小，表明黑麦多酚处理组泥鳅MP表面疏水性较低。在贮藏15 d后，4.5 g/L处理组泥鳅MP与溴酚蓝的结合量低于其它两个处理组(P＞0.05)。泥鳅MP表面疏水性随微冻时间的延长而增大主要是由于贮藏过程中蛋白质被氧化变性导致其结构发生改变，表面疏水性基团暴露，表面疏水性增加，此外，MP中巯基的氧化反应也可导致蛋白质表面疏水性的增加。而黑麦多酚处理组泥鳅MP贮藏过程中表面疏水性降低，说明黑麦多酚能一定程度上减缓蛋白质的氧化以及变性，这一结果与报道的0.3%茶多酚能延缓－2℃冷藏下大黄鱼鱼片肌原纤维蛋白变性和降解程度，－80℃冻藏大黄鱼肌原纤维蛋白的氧化程度低于－18℃的结果相一致［20－21］。充分说明作为天然抗氧化剂的多酚类物质在抑制蛋白的氧化变性方面具有较好的作用。

图2 黑麦多酚处理对泥鳅肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig.2 Effects of rye polyphenols on the surface hydrophobicity of loach MP during storage

2.3 不同处理对泥鳅贮藏过程中MP羰基、巯基含量的影响

肌原纤维蛋白中的羰基和巯基含量高低常用来间接评价蛋白质被氧化的程度，羰基含量的增加、巯基含量的下降表明蛋白质氧化程度的增加，泥鳅肌原纤维蛋白中羰基和巯基含量可间接反映泥鳅的新鲜度，本实验在冰温贮藏期内各组泥鳅感官评价都在可接受范围，而黑麦多酚处理组效果更好。羰基的形成与肽骨架的断裂、一些氨基酸侧链被活性氧攻击有关［22］。而巯基基团具有活泼、反应活性高的特性，是肌原纤维蛋白的功能基团，在维持肌原纤维蛋白空间结构的稳定性方面具有重要的作用，肌原纤维蛋白变性后往往伴随着结构发生变化，从而使巯基暴露后部分被氧化成－S－S－，总巯基含量明显降低［23］。而巯基对蛋白质的乳化性以及凝胶性有重要的影响［24］。不同处理泥鳅贮藏过程中MP羰基、巯基含量变化如图3、图4所示，从中可以看出各处理组MP的羰基含量都随着贮藏时间的延长不断上升而巯基含量不断下降，对照组在贮藏10 d时羰基含量由2.7 nmol/mg蛋白显著增加到4.1 nmol/mg蛋白(P＜0.05)，而贮藏15 d时巯基含量由9.7 mmol/105mg蛋白显著下降到7.1 mmol/105mg蛋白(P＜0.05)，这与冰温贮藏过程中泥鳅MP的氧化以及空间结构的破坏有关。贮藏第15～30 d，各黑麦多酚处理组羰基含量都低于对照组而巯基含量高于对照组，其中4.5 g/L处理组效果较好(P＜0.05)，贮藏第15和30 d时巯基含量分别为7.7、5.5 mmol/105mg蛋白，而羰基含量分别为4.3、6.2 nmol/mg蛋白，说明黑麦多酚一定程度上减缓了泥鳅MP的氧化和降解，抑制了羰基含量的增加和巯基含量的下降，从而保证了泥鳅MP相对完整性和较好的溶解性等功能特性，与窦川林［6］、李倩［25］、Ramirez等［26］研究的结果相似。

图3 黑麦多酚处理对泥鳅肌原纤维蛋白羰基含量的影响Fig.3 Effects of rye polyphenols on the carbonyl content of loach MPduring storage

图4 黑麦多酚处理对泥鳅肌原纤维蛋白巯基含量的影响Fig.4 Effects of rye polyphenols on the sulfhydryl content of loach MP during storage

2.4 不同处理对泥鳅贮藏过程中MP乳化活性和乳化稳定性的影响

蛋白质的乳化能力是衡量蛋白质溶液乳化脂肪的能力，表现为其能与水和脂肪的结合程度［27］。有研究表明蛋白质乳化能力与其溶解度呈正相关，溶解度越高，乳化能力越好［28］。不同处理泥鳅贮藏过程中MP乳化活性和乳化稳定性的变化如图5、图6所示，从中可以看出各处理组MP的乳化活性和乳化稳定性都随着贮藏时间的延长而不断降低，但各处理组的EAI和ESI值都高于对照组。在0～10 d贮藏期间，各处理组与对照组EAI值差异不显著(P＞0.05)，15 d时各处理组EAI值分别为27.32%、26.85%和27.16%，显著高于对照组25.24%(P＜0.05)。在贮藏5～25 d过程中，3.0、4.5 g/L黑麦多酚处理组的ESI值显著高于对照(P＜0.05)。各处理组泥鳅MP在冰温贮藏过程中乳化能力的下降可能与蛋白质氧化和变性致使原有的蛋白空间结构被破坏，肌球蛋白的交联程度增加，使蛋白质不能形成稳定的界面膜而丧失了表面吸附脂肪颗粒的活性有关。同时随着贮藏时间的延长蛋白质溶解性的降低也会导致其乳化活性下降［29］。本试验结果表明经过黑麦多酚处理后的泥鳅在冰温贮藏过程中MP的乳化能力的下降明显较对照组低，这与黑麦多酚抑制泥鳅MP的氧化变性、延缓肌原纤维蛋白溶解性的降低有关，与图1的结果相呼应。与李艳青［30］报道的添加WPI水解物可抑制鲤鱼肌原纤维蛋白的氧化，从而保持其较好的乳化活性的结果相一致。茶多酚、WPI水解物、黑麦多酚等天然抗氧化剂在抑制蛋白氧化变性、维持蛋白结构完整，从而保持蛋白溶解性、乳化性、凝胶性等基本的功能特性方面具有较好的作用，相比化学合成抗氧化剂安全性更好。

图5 黑麦多酚处理对泥鳅肌原纤维蛋白乳化活性的影响Fig.5 Effects of rye polyphenols on the emulsifying activity of loach MPduring storage

图6 黑麦多酚处理对泥鳅肌原纤维蛋白乳化稳定性的影响Fig.6 Effects of rye polyphenols on the emulsifying stability of loach MP during storage

3 结论

在冰温贮藏过程中各处理和对照组泥鳅MP的总巯基含量不断下降而羰基含量不断上升，同时溶解性、乳化性降低而表面疏水性增加，黑麦多酚对冰温贮藏过程中泥鳅肌原纤维蛋白功能性质有明显影响，抑制了羰基的生成、保护了巯基，降低了MP的表面疏水性，提高了其溶解度，且质量浓度越大效果越明显，4.5 g/L处理效果较佳。泥鳅产品进行黑麦多酚处理能够有效抑制冰温贮藏过程中蛋白质的氧化以及功能性质的弱化，作为天然抗氧化剂可以用于泥鳅的贮藏保鲜。