lncRNA ANRIL rs2383207及其交互效应与急性缺血性脑卒中早期神经功能恶化的关系

黄燕，周嫱，陈小灵，唐志，何发毅，冯玉环，柳华,

(1.盐亭县人民医院神经内科，四川 绵阳 621600；2.成都市第三人民医院·西南交通大学附属医院神经内科，四川 成都 610031；3.盐亭县人民医院神经外科，四川 绵阳 621600)

脑血管病的致死率在我国位居首位，其中缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是主要的脑血管事件，约占所有卒中的80%。部分CIS患者发病后症状体征趋于恶化，即早期神经功能恶化(early neurologic deterioration，END)。急性CIS期间END较常见，临床发生率可高达40%。END与卒中后结局不良密切相关，增加了患者死亡率[1]。因此，研究END预测因素加以有效防控极其重要。END发生危险因素众多[2]，由于CIS是一种具有强烈遗传背景的多因素疾病，且CIS与END病理生理机制类似，因而END的易感基因研究有一定的必要性。位于9p21.3区域上的INK4座中反义非编码RNA (antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)基因与动脉粥样硬化风险密切相关，ANRIL rs2383207则是CIS发病的易感位点[3]。本研究拟探讨ANRIL rs2383207位点及其与传统危险因素的交互效应对急性CIS期间END的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用前瞻性巢式病例对照研究设计，连续收集从2017年12月至2019年6月盐亭县人民医院神经内科收治的急性CIS患者。纳入标准为：(1) CIS诊断符合世界卫生组织(World Health Organization，WHO)标准：电子计算机断层扫描/磁共振成像(computed tomography/ magnetic resonance imaging，CT / MRI)检查及临床表现，急性起病、局灶神经功能缺损并持续性24 h以上、排除非血管性病因，排除脑出血和蛛网膜下腔出血；(2) 发病48 h内入院；(3)同意参与研究。排除有明确原因的继发性脑梗死患者和合并严重其它严重疾病的患者，另外，也排除了住院不满7 d者、接受静脉溶栓和血管内介入治疗者及出血转化的患者。医院伦理委员会批准了本研究，参与研究者签署了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集与评估 入院24 h内，收集所有研究对象的临床资料，包括：(1)人口学特征：年龄、性别、身高、体重，并计算身体质量指数(body mass index，BMI)；(2)脑血管病危险因素：如高血压、糖尿病、血脂异常、心房颤动、冠状动脉粥样硬化性心脏病、卒中、吸烟、饮酒等；(3)部分实验室指标：入院空腹血糖、血常规、凝血功能，血液生化指标 [包括超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hsCRP)，血同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)等]。

1.2.2 研究指标 (1)使用美国国立卫生研究院卒中量表(national Institute of Health stroke scale，NIHSS)评估神经功能缺损程度；(2)END定义为入院一周NIHSS评分中运动功能项增加至少1分或总分增加至少2分[4]；(3)高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHCY)定义为血浆Hcy >10 μmol/L；(4)高危CRP定义hsCRP>3.0 mg/L[5]；(5)高尿酸定义为非同日2次血尿酸水平>420 μmol /L[6]；(6)神经功能损伤程度较重定义为NIHSS > 5[7]；(7)入院高血糖根据1998年WHO标准：空腹 ≥7.0 mmol /L，或随机 ≥11.1 mmol /L；(8)入院高血压根据1999年WHO高血压标准：即收缩压 ≥ 140 mmHg(和/或)舒张压 ≥ 90 mmHg；(9)吸烟史定义为平均每日吸烟1支以上，时间大于1年；饮酒史定义为平均每周饮白酒至少1次，时间大于1年[8]；(10)血脂异常依据2016年修订版中国成人血脂异常防治指南：甘油三酯(triglyceride，TG)> 1.7 mmol/L(150 mg/dL)、血清总胆固醇(serum total cholesterol，TC)> 5.20 mmol/L (200 mg/dL)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)> 3.40 mmol/L(140 mg/dL)；(11)超重定义为BMI≧24 kg/m2。

1.2.3 rs2383207位点分型 (1)样本脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)获取：取受试者外周静脉血2 mL，枸橼酸钠抗凝，使用血液基因组DNA提取试剂盒(DP318-02/03，北京TIANGEN)按说明操作。(2)基因分型：采用imLDR多重SNP分型平台(上海天昊)[9]。具体操作步骤如下：①DNA样本工作浓度为5～10 ng/μL；②多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)：反应体系10 μL包括1×GC-I buffer(Takara)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μL样本DNA和1 μL引物，见表1。循环程序为：首先95 ℃循环 2 min；第二步进行11个循环[94 ℃ 20 sec、65 ℃ 40 sec(每次循环依次降低 0.5 ℃)、72 ℃ 1.5 min]；第三步进行24个循环(94 ℃ 20 sec，59 ℃ 30sec，72℃ 1.5 min)；第四步72 ℃ 循环2 min，4 ℃保存；③PCR产物纯化：10 μL PCR产物加5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃温浴1 h，75 ℃灭活15 min；④连接反应：反应体系为10×连接缓冲液1 μL、高温连接酶 0.25 μL、5’连接引物混合液(1 μM) 0.4 μL、3’连接引物混合液(2 μM) 0.4 μL(表1)、纯化后的多重PCR产物 2 μL、ddH2O 6 μL 混匀。连接程序首先进行38个循环(94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min)，4 ℃保存；⑤测序及分析：取0.5 μL 稀释后的连接产物与0.5 μL Liz500 SIZE STANDARD和9 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性5 min后上ABI 3730XL测序仪，收集的原始数据用GeneMapper 4.1 (ABI，USA) 进行分析。

表1 SNP分型所用引物名称及序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料分析

391例CIS患者纳入分析，116例发生END(29.7%)，非END共275例(70.3%)。两组在的性别、年龄差异方面无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。单因素分析发现，END组NIHSS>5评分、入院高血糖、HHCY和高危hsCRP值比例明显高于非END组(P<0.05)。多元Logtic回归分析调整协变量后，两组NIHSS>5评分，入院高血糖和HHCY差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 纳入研究对象的特点及Logistic回归分析

2.2 rs2383207 SNP分析

2.2.1 基因分型及相关性分析 所有样本都成功进行了rs2383207位点分型，在显性模型下，GG型增加了END风险(调整后的GG基因型：OR=2.143，95%CI：1.293-3.550，P=0.003)；在等位基因比较模型下，A等位基因具有保护效应，降低了END发生风险(OR=0.691,95% CI：0.497-0.961，P=0.028)。见表3。

表3 不同遗传模型下rs2383207位点在END组和非END组中的分布

2.2.2 ANRIL基因rs2383207和END传统危险因素的交互分析 将END单因素分析中P<0.1的因素(年龄≥65、WBC异常、TIA史、饮酒、糖尿病史、高危hsCRP、HHCY、入院高血糖和NIHSS>5评分项)与391条样本记录资料导入MDR软件，作了1-4阶不同交互情况下的模型。结果显示，二阶交互模型rs2383207和NIHSS>5评分具有最好的平均检验准确度和交叉验证一致性(Testing BA：0.593 3，CVC：9/10，P=0.286)，因此选择此模型作为最佳模型，Logtic回归分析显示NIHSS>5分人群同时携带rs2383207 GG基因型END发生风险增加，但是没有显示出统计学差异(OR=1.696，95%CI:0.607～4.736，P=0.313)。见表4。

表4 rs2383207 SNP与传统危险因素基于1-4阶交互作用分析

3 讨论

本研究显示，急性CIS入院7 d内END发生率为29.7%。Hu等[10]研究表明，在中国人群中，住院CIS患者7 d内END发病率为20.2%～42.5%，与本研究类似。

入院NIHSS>5分、入院高血糖和HHCY的患者更容易发生END。END发生机制包括缺乏有效侧枝循环、血栓进展、卒中复发、颅内压增加、癫痫和出血转化等。NIHSS评分与脑梗死或水肿面积密切相关，梗死后的多种并发症及氧自由基释放可能是患者发生END的重要原因，并且卒中的严重程度与END发生率成正比[11]。这可能是由于空腹血糖升高可导致脑组织乳酸和氧自由基等有害物质产出增加，加重脑细胞损伤；高血糖具有血栓前效应，可能促使血栓扩展；高血糖微血管病变可影响侧枝循环，使患者对血压变动更敏感，由此加重低灌注风险，与Jaume等[12]研究基本一致。HCY参与血管内皮损伤后修复、血管平滑肌增殖过程，与动脉粥样硬化、血栓形成有关，而HHCY血症是脑血管疾病的高危因素，降低HCY的卒中患者预后较好[13]。且HHCY也是预测END的独立危险因素[4]，由于HCY与人群END风险密切相关[14]。

本研究发现，rs2383207 GG型增加了END风险，A等位基因具有保护效应。ANRIL与心脑血管事件密切相关，其中ANRIL rs2383207位点与冠状动脉粥样硬化性心脏病和CIS的发病风险息息相关[15-18]。由此推测，ANRIL rs2383207可能参与了CIS-END 发病。

本研究进行了ANRIL基因rs2383207位点与END传统危险因素交互作用分析，rs2383207位点与NIHSSS>5两个因素间的交互效应可能与END风险有关，尽管在最后的验证中未见统计学差异，但仍可推测，END的发病可能在一定程度上与遗传和环境多种因素交互作用相关，且在遗传易感性基础上，发病时的神经功能受损的严重程度可能会增加END的发生风险。

综上所述，ANRIL基因、入院高血糖、HHCY和神经功能缺损程度与急性CIS后END发病有关，END传统危险因素和易感基因间的交互作用可能参与了END的发病。