运动通过p38MAPK信号通路影响成长期小鼠骨代谢

凌丽丽，李桂芳，王彪，赵学辉，刘会领，李建英，王新梅

(1.沧州市人民医院新生儿科；2.沧州市公安局刑警支队，河北 沧州 061000)

雄激素受体(androgen receptor，AR)介导基因能够通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等非基因途径对蛋白的合成过程进行调控[1-2]，MAPK信号通路属于Ser/Thr蛋白激酶家族重要因子，通过适当运动能够将MAPK信号通路激活，进而诱导抗氧化酶基因表达，提高机体的抗氧化能力，达到预防疾病及延缓衰老的目的[3-4]。p38为MAPK家族的成员之一，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路在细胞凋亡、炎症反应、骨代谢等过程中均能发挥重要的调控作用[5-6]。雄激素具有抑制骨骼肌萎缩、促进骨骼肌肥大和肌肉力量的作用，可增强运动能力[7-8]；而运动训练是预防骨质疏松的有效方式，青少年中长期参加体育锻炼的人群具有更长、更粗壮的骨骼，且骨骼的质量、形状与其所处力学环境密切相关，通过适当运动建立良好的力学环境能够改善骨代谢[9-10]。本研究拟探讨运动如何通过p38MAPK信号通路影响成长期小鼠骨代谢，为后期临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物模型

40只8周龄C57/BL6雄性小鼠购于广西医科大学实验动物中心(合格证号：scxk桂20190002)，体质量为20～22 g。采用随机数字表法分为运动组和对照组，每组各20只，各组小鼠适应性喂养1周后进行实验。

对照组进行普通饲养，不给予任何干预。运动组第1周运动6 d，前3 d运动30 min/d，后3 d运动45 min/d；第2周～8周运动5 d/周，运动45 min/d，设定跑速为0.8 km/h，坡度-9°。

1.2 方法

1.2.1 生物材料 血清：最后一次训练结束后的第3天使用断头法处死各组小鼠，将眼球摘除后取眼眶血移入1.5 mL离心管内，以5 000 rpm的速率离心10 min，取上层血清，置于-80 ℃冰箱内保留待测。右侧胫骨和股骨：将小鼠骨骼表面的肌肉剥离，取出胫骨和股骨，使用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)将骨组织样本清洗干净，分装在离心管内，置于4 ℃冰箱内保留待测。本实验中因样本量较大，且各组小鼠试验前均为健康小鼠，因此该实验中仅对右侧胫骨和股骨进行观察。脑：处死小鼠后开颅取脑，在4 ℃下使用4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋后切片。

1.2.2 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 使用ELISA对血清钙(serum calcium，Ca)、血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP/ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，STR-ACP)、骨钙素(osteocalcin，BGP)、血清磷(phosphorus，P)水平进行检测。仪器为LFF-LC-1781全自动生化分析仪(美国贝克曼生物有限公司)，试剂从迈瑞生物科技有限公司购买(货号：2020041113)，具有5年以上临床经验的专家严格按照说明书操作。具体如下：(1)离心取上层血清；(2)在微定量板上吸附组蛋白体；(3)加上清液使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；(4)加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合；(5)加酶的底物，测光吸收强度。

1.2.3 生物力学指标检测 使用微机控制电子万能试验机(济南方圆试验仪器有限公司；型号：WDW-50E/100E)对小鼠的右侧股骨各生物力学指标进行检测，将股骨放置在两个支撑点上，标本宽度朝上且水平放置，将探头下降，以2 mm/min的速度施压，标本断裂后停止，依据压力传感器数据获得相应指标数据，包括弹性载荷、最大载荷、破坏载荷、弹性挠度、最大挠度、破坏挠度、能量吸收和刚性系数。具体如下：(1)打开微机控制电子万能试验机主机电源、电脑，点击桌面Smarttest软件，打开专业测控软件；(2)进入拉力机操作界面，首先选择所使用的试验方法，此时软件右侧将会显示数据板栏目；(3)点击新建按钮，根据试样的实际规格尺寸输入到数据板里面，完成后关掉数据板；(4)调节衡量位置，将股骨放置在两个支撑点上，标本宽度朝上并水平放置；(5)清零试验数据，确认试样无异常，点击界面改到试验界面，以2 mm/min的速度施压，标本断裂后停止；(6)各数据均实时显示，可记录或打印。

1.2.4 Western blot印迹检测 对小鼠的血小板衍生生长因子B(platelet derived growth factor，PDGFb)、c-fos蛋白、细胞外调节蛋白激酶-1(extracellular regulated kinase protein，ERK-1)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(phosphorylated mitogen-activated protein kinase，P-MAPK)蛋白表达水平及磷酸化p38(p-P38)、黑质环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)水平进行检测。(1)分离黑质区(图1)：小鼠快速断头处死，取出完整脑，将脑至于-80 ℃速冻5 min。取出速冻好的鼠脑，置于冰上，切取前囟(在剥离的鼠脑上，前囟和腹侧的视交叉前缘处于同一垂直面上)后，3～4 mm的冠状切面。在鼠脑切面上，黑质脑区的颜色是与其它脑区颜色不同的，有比较清晰的界限，用镊子或者其它工具挖取获得。(2)使用Western blot印迹法对小鼠黑质区p-P38、COX-2、caspase-3水平进行检测。依据试剂盒(迈瑞生物科技有限公司购买；货号：2020061719)提取蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒(迈瑞生物科技有限公司购买；货号：2020082111)对裂解物的蛋白浓度进行测定，聚丙烯酰胺凝胶电泳，参照免疫印迹说明进行转膜等过程，p-P38、COX-2、caspase-3、PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK曝光显影，重复3次。具体如下：(1)将蛋白电泳后的凝胶浸入电转缓冲液中15 min。(2)将电转膜(醋酸纤维素膜)先在甲醇中浸泡至完全湿润，然后再将膜浸入超纯水中5 min，最后再将膜浸入电转液中15 min。(3)滤纸先在电转液中完全浸湿，然后将滤纸平铺在电转纤维上，在滤纸正上方平铺凝胶，在凝胶正上方平铺电转膜，在电转膜正上方平铺滤纸，最后用玻棒赶气泡。(4)100 V，电转100 min。(5)电转结束后，将电转膜浸泡于甲醇中5 min，最后将电转膜浸泡于4 mL 10%的牛奶(2 g奶粉溶于20 mL超纯水)中(5% BSA)，置于37 ℃摇床(75 rpm)封闭1.5 h(也可4 ℃封闭过夜)。(6)封闭1.5 h结束后，电转膜用磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline+Tween-20，PBST)(1LPBS溶液+500 uL Tween-20)洗3次，每次10 min。(7)将电转膜浸入一抗溶液中，置于37 ℃摇床，75 rpm，1.5 h(一抗溶液的制备：10 mL的10%脱脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10 uL一抗，即共稀释了1 000～2 000倍，可根据需要自行设计抗体稀释倍数)。(8)一抗溶液浸泡结束后，将电转膜用PBST溶液洗3次，每次10 min。(9)将电转膜浸入二抗溶液中，置于37 ℃摇床，75 rpm，1 h(二抗溶液的制备同一抗)。(10)二抗溶液浸泡结束后，将电转膜用PBST溶液洗3次，每次10 min。然后，将膜浸泡于底物溶液中显色，显色结束后，用滤纸吸干膜上的水分，将膜置于凝胶成像仪中用白光拍照。滴加发光液凝胶成像仪采集图像，计算蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值，以反映目的蛋白的表达。使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，分析目的蛋白的相对含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组血清生化指标水平比较

ELISA法检测结果显示，运动组小鼠的Ca、AKP、ALP、STR-ACP、BGP水平均高于对照组，血清P水平低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 血清生化指标水平比较

2.2 两组右侧股骨生物力学指标比较

微机控制电子万能试验机检测结果显示，运动组小鼠股骨生物力学指标均优于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 右侧股骨生物力学指标比较

2.3 两组PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白表达水平比较

Western blot印迹法检测结果显示，运动组小鼠的PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白的表达水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3、图2。

表3 PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK蛋白表达水平比较

2.4 两组黑质区p-P38、COX-2、caspase-3水平比较

Western blot印迹法检测结果显示，运动组小鼠的黑质区p-P38、COX-2、caspase-3水平均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4、图3。

表4 黑质区p-P38、COX-2、caspase-3水平比较

3 讨论

Goodyear等[11]在1996年就运动对大鼠骨骼肌细胞ERK1/2、p38、JNK信号分子的激活作用进行了探究，近年来，骨骼肌中的MAPK信号转导通路的调节问题逐步成为研究的热点，肌肉收缩与运动对p38MAPK信号转导通路的调节作用备受关注[12-13]。谢学海等[14]发现，人体和正常大鼠耐力运动后，48 h骨骼肌p38蛋白活性与含量受影响。同时，陈彤丹等[15]也指出，在相同的相对强度运动下，接受过运动训练的患者骨骼肌p38MAPK信号转导通路具有更强烈的反应。

生长发育期内的骨量增加所达到的峰值大小，对于人群老年时期发生骨质疏松有着重要作用。p38MAPK是含有360个氨基酸的络氨酸磷酸化蛋白激酶，临床中能够激活p38的刺激较多，热休克、蛋白质合成抑制剂、高渗透压环境等应激刺激及脂多糖等均能激活p38通路[16]。此外，骨质疏松症的发生与维生素D的缺乏密切相关，维生素D水平低下，膳食中钙质摄取量较低，长时间会造成骨量丢失[17]。维生素D是免疫调节中的重要成分，其在免疫系统多种成分中可作为自分泌及旁分泌信号系统，免疫调节中需要消耗大量的维生素D[18]。

本研究显示，运动组的各血清生化指标、右侧股骨生物力学指标均优于对照组，进一步探究发现观察组小鼠的MAPK信号通路相关因子(PDGFb、c-fos、ERK-1、BMP-2、P-MAPK)、BMP-2 mRNA相对表达量及p-P38、COX-2、caspase-3水平均优于对照组。这可能是由于运动激活了p38分子，并刺激了其下游信号分子MAPKAPK2，将核底物直接磷酸化，增强了底物的活性。调控骨代谢的重要手段之一为运动训练，其不仅能够增加骨量，还能够促进骨形成代谢，适宜的运动刺激能够有效促进骨形成[18-19]。本研究中运动组大鼠通过运动改善了骨代谢，减少了对维生素D的消耗，原因可能为维生素D与钙离子结合形成钙维生素D复合物，对甲状旁腺及细胞因子进行了调控，减少了骨吸收量，降低了皮质骨多孔的发生率，刺激骨钙素、骨桥蛋白等骨基质蛋白及骨生长因子的生成，促进骨微细损伤的修复和骨矿化，调节了骨重建，进而改善了骨代谢[20]。

综上所述，运动能够激活成长期小鼠的p38MAPK信号通路相关细胞因子的表达，改善骨代谢，增加骨密度。