鹿鞭醇提物对秀丽隐杆线虫衰老的影响

2021-06-18迟东泽刘芳芳

食品工业科技 2021年10期

迟东泽，何源，刘芳芳，张晶,

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.长春科技学院医药学院，吉林长春 130600）

衰老是指随着年龄增长，机体功能逐渐下降的过程，可导致多种慢性类疾病，如阿尔茨海默证、癌症、糖尿病和心血管疾病[1]。中医理论认为肾精不足、气血亏虚是导致衰老的主要原因[2]，而传统的补益类中药具有补气、补血、滋阴、壮阳等功效，灵芝水提物[3]、玛咖醇提物[4]等均具有较强的抗衰老活性。

秀丽隐杆线虫是首个具有完成基因组测序的动物，60%～80%与人类基因具有同源性似，其行为和生理指标变化与人类较为相似，被广泛应用于生物活性化合物的抗衰老作用研究[5]。

中药鹿鞭（Penis et Testis Cervi）又称鹿肾、鹿冲，为鹿科动物梅花鹿（Cervus nipponTemmink）或马鹿（CelaphusLinnaeus）干燥带睾丸的阴茎[6]，为传统补益类中药，其化学成分主要包括核苷类、氨基酸类、脂肪酸类、糖类、甾体类、无机元素、多胺类、磷脂类[7]。现代研究表明，鹿鞭中性激素可提高肾阳虚不育症大鼠睾酮水平、对大鼠生精功能起到调节作用[8]。鹿鞭活性肽具有抑制硫代巴比妥酸反应（TBARS）、增强还原能力、提高DPPH自由基清除率的功效[9]。鹿鞭乙醇提取物可延长小鼠负重游泳时间，降低运动后小鼠尿素氮（BUN）、血乳酸（BLA）和丙二醛（MDA）水平，提高小鼠抗疲劳能力[7]。然而，关于鹿鞭抗衰老活性研究未见报道，因此本文以秀丽隐杆线虫衰老为模型，通过测定线虫寿命、吐咽、生殖能力、运动能力、热应激、氧化应激、体内抗氧化酶活力等指标，研究鹿鞭醇提物的抗衰老活性及可能机制，并比较了梅花鹿鞭和马鹿鞭活性，以期为鹿鞭药材的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

梅花鹿鹿鞭、马鹿鞭分别购于吉林双阳西丰鹿场和新疆本草堂有限公司，由张晶教授鉴定为新疆马鹿鞭（CelaphusLinnaeus）和梅花鹿鞭（Cervus nipponTemmink），两种鹿鞭粉碎后过100目筛，粉末存于-80 ℃，待用；野生型秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis.elegans）N2型由吉林农业大学人参工程创新研究中心提供；胆固醇、琼脂粉、蛋白胨

国药试剂有限公司；百草枯美国Sigma公司；OP50菌种北京三药公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠分析纯，天津福晨试剂公司；氯化钠、硫酸镁、氢氧化钠、次氯酸分析纯，上海国药试剂公司；活性氧ROS试剂盒、ELISA试剂盒上海碧云天生物技术有限公司。

BS-250生化培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Thermo FisherST16R高速离心机昊诺斯科技有限公司；PL303 电子分析天平梅特勒托利多仪器有限公司；RS-232C MK3酶标仪 Thermo Labsystems公司；KQ5200DB超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；Olympus-BX41奥林巴斯显微镜奥林巴斯公司；IX71IX71倒置荧光显微镜日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鹿鞭醇提物的制备精密称取梅花鹿鞭和马鹿鞭样品粉末15.000 g，加入80%乙醇150 mL超声提取（功率250 W，频率33 kHz，温度50 ℃）3次[7]，每次1 h，合并提取液，浓缩至干，得花鹿鞭醇提物（HC）马鹿鞭醇提物（MC），待用。

1.2.2 培养基的制备 NGM培养基配制：准确称取NaCl 1.50 g、琼脂粉8.50 g、胰蛋白胨1.25 g、5.0 mg/mL胆固醇乙醇溶液500 μL，水定容至500 mL，高压灭菌15 min，室温冷却至55 ℃，加入500 μL 1 mol/L CaCl2、500 μL 1 mol/L MgSO4、12.5 mL 1 mol/L PBS缓冲液，混匀后倒入培养皿中。

1.2.3 线虫的培养及同步化线虫培养：将线虫接种于含OP50的NGM培养基，20 ℃恒温培养。线虫同步化：采用高氯酸钠裂解法[10]，M9缓冲液将线虫从NGM上冲下，置于EP管中静置1 min，弃掉上清液，加入一定量的M9缓冲液，再加入等体积的裂解液（NaClO:NaOH=1:1），震荡约3 min，5500 r/min离心30 s，弃掉上清液，加入1 mL M9缓冲液吹散，离心，重复3次后，沉淀即为线虫卵，置于NGM培养皿上，20 ℃培养。将同步化后的秀丽隐杆线虫转移到含有大肠杆菌OP50的培养基中，空白组滴加蒸馏水，各剂量组分别加入0.5 mg/mL（低剂量组）、1.0 mg/mL（中剂量组）、2.0 mg/mL（高剂量组）鹿鞭醇提物，20 ℃培养。

1.2.4 寿命测定将L4期线虫分别转移各组NGM培养皿中20 ℃培养。每组3个平行，每个培养皿约33条线虫。从线虫孵化开始记为第0 d，每天转移至新培养皿中，到生殖后期（通常为第5 d）后，每48 h线虫移至新培养皿，每天观察线虫，记录线虫生存、死亡数量[11]。

1.2.5 吐咽能力测定取L4期线虫于各组培养皿，显微镜下观察其1 min内的吐咽次数，并进行统计，每日转板[12]。

1.2.6 生殖能力测定每个培养皿2条L4期线虫，各剂量组分别5个平行。每天将线虫移至新培养皿，至线虫基本不再产卵，记录产卵总数，计算各剂量每条线虫产卵量的平均值[13]。

1.2.7 秀丽隐杆线虫急性热应激和氧化应激实验

1.2.7.1 急性热应激实验采用L4期线虫按“1.2.3”方法进行分组给药后，于20 ℃培养48 h，将培养温度调至35 ℃，此时设为0 h。每组3个平行，每个培养皿约33条线虫。每2 h挑出死亡线虫后继续培养，至全部死亡[14]。

1.2.7.2 氧化损伤实验将同期化线虫移至相应培养皿中，20 ℃培养48 h（每日转板）后，转移至10 mmoL/L百草枯平板上，建立氧化损伤模型。每组3个平行，每个培养皿约33条线虫。每天统计线虫数量，计算其存活率（存活率（%）=存活条数/总条数×100）[15]。

1.2.8 运动能力测定在寿命实验的第4、8、12 d观察并记录线虫的运动情况。记录标准：A型：线虫自发运动，不需要触碰刺激；B型：线虫必须受到触碰刺激才运动；C型：线虫受到触碰刺激后只摆动头或尾[16]。

1.2.9 ROS水平测定将L4期线虫移至含10 mmoL/mL百草枯各培养皿中，20 ℃培养48 h（每日转板），将其转移至浓度为100 μmoL/L H2DCFDA缓冲液中，20 ℃孵育40 min，观察荧光强度（λex=485 nm，λem=528 nm[17]。

1.3 抗氧化酶活力及MDA含量测定

将同期化L4期线虫转移至各培养皿中，培养48 h后，用M9缓冲液冲将线虫冲至离心管。生理盐水洗涤并于液氮中反复冻融3次，离心取上清液用ELISA试剂盒测定SOD、CAT活力及MDA水平[18]。

1.4 统计分析

实验数据以X±SD表示，采用prism8软件作图，SPSS 23.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 鹿鞭提取物对寿命的影响

2种鹿鞭醇提物对线虫寿命影响（图1、表1）结果显示，HC的各剂量组（0.5、1、2 mg/mL）可显著提高线虫寿命且呈浓度依赖性，与空白组相比，平均寿命分别分别提高17.06%、20.08%、35.82%；中位寿命分别提高约2.29、3.23、4.39 d；最大寿命分别提高约2.98、4.55、5.58 d。与空白组相比，MC组中不同浓度醇提物平均寿命分别提高13.39%、17.33%、23.52%；中位寿命分别提高约0.9、2.85、3.3 d；最大寿命分别提高约2.93、3.96、5 d。HC和MC组在0.5、1.0 mg/mL水平，线虫寿命值与空白组相比均具有显著差异（P＜0.05），浓度为2.0 mg/mL水平具有极显著差异（P＜0.01）。2种鹿鞭均可延长线虫寿命，在同一剂量水平，HC对线虫寿命的影响大于MC。

图1 鹿鞭醇提物对线虫寿命的影响Fig.1 Effects of alcohol extract from penis cervi on the life span of C.elegans

2.2 吐咽能力测定

线虫的吐咽频泵频率反应了线虫对药物的摄入情况和活动能力，随着线虫年龄的增长而降低[19]。结果表明（图2、表2），空白组1 min内的平均吐咽频率为128±5.09，HC各剂量组（0.5、1、2 mg/mL）平均吐咽频率为131.93±4.62、143.33±6.18、156.06±8.73次/min；MC组中平均吐咽频率分别为134.33±3.54、141.87±5.21、150.73±3.43 次/min。与空白组相比，2种鹿鞭醇提物在给药浓度为1.0 mg/mL水平可显著提高线虫的吐咽能力（P＜0.05），2.0 mg/mL水平极显著提高线虫吐咽能力（P＜0.01）。与空白组相比，HC中高剂量组（1.0、2.0 mg/mL）对线虫吐咽频率分别提高11.71%、21.92%；MC中高剂量组对线虫吐咽频率分别提高10.83%、19.95%。在同一剂量水平，HC和MC对线虫吐咽能力均无显著差异（P＞0.05）。

2.3 生殖能力测定

如图3所示，线虫在产卵期的第1～3 d产卵能力较强，但随着寿命的增加，生殖能力逐渐下降，直至第5 d，基本不再产卵。根据前5 d内的总子代数统计，与空白组相比，HC和MC各剂量组总子代个数无显著差异，表明鹿鞭在发挥抗衰老活性时，并未损害其生殖能力。

表1 鹿鞭提取物对线虫寿命的影响Table 1 Effect of penis cervi extract on the lifespan of nematodes

图2 鹿鞭醇提物对线虫咽泵频率的影响Fig.2 Effect of alcohol extract from penis cervi on longevity pump frequency of C.elegans

表2 鹿鞭醇提取物平均吐咽频率（次/min）Table 2 Average frequency of vomiting and swallowing of penis cervi alcohol extract (time/min)

2.4 运动能力测试

图3 鹿鞭醇提取物对线虫繁殖能力的影响Fig.3 Effect of alcohol extract from penis cervi on the reproduction of C.elegans

衰老可导致肌肉退化，随着年龄的增长运动能力逐渐下降[20]。实验观察了鹿鞭醇提物对第4、8和12 d线虫运动能力的影响（图4～图5）。第4 d，线虫处于生命过程的早期阶段，空白组与鹿鞭醇提物组均有60%以上线虫保持在运动A状态，各组间无差异。第8 d，2种鹿鞭各剂量组与第4 d相比，运动A状态线虫显著减少，而运动B和运动C线虫显著增加（P＜0.05）。与空白组相比，HC各剂量组（0.5、1、2 mg/mL）线虫运动A状态显著提高了8.34%、14.03%、29%；HC与MC组相比，分别提高了1.7%、2.8%、8.3%。第12 d，空白组中有25%线虫为运动C状态，而HC高剂量组（2.0 mg/mL）中有71.67%的线虫保持在运动A或B，显著高于对照组；2.0 mg/mL HC组较MC组高7.01%。因此，2种鹿鞭均可显著改善线虫的运动能力，在同一剂量水平，HC对线虫运动状态影响优于MC。

2.5 热应激实验

图4 花鹿鞭（HC）醇提取物对线虫运动能力的评估Fig.4 Evaluation of penis cervi alcohol extract on motility of C.elegans

高温可导致生物体内ROS水平增加，破坏自由基稳定，引起氧化应激，进而引起衰老[21]。35 ℃条件下，鹿鞭醇提物对线虫抵抗热应激能力影响（图6、表3）结果显示，不同剂量HC组（0.5、1、2 mg/mL）中线虫的平均生存时间分别较对照组提高了11.97%、26.54%、44.78%，MC组的平均存活时间分别提高12.56%、15.76、25.71%。2种鹿鞭醇提物均显著提高线虫的平均生存时间。2.0 mg/mL水平，HC组平均生存时间为12.22±0.28 h，显著高于MC组10.61±0.17 h（P＜0.05）。因此，鹿鞭醇提物可提高对线虫对热应激的保护作用，延长线虫的平均生存时间，在2.0 mg/mL水平，HC对线虫热应激抵御力大于MC。

图5 马鹿鞭（MC）醇提取物对线虫运动能力的评估Fig.5 Evaluation of penis cervi alcohol extract on motility of C.elegans

图6 鹿鞭醇提物对线虫热应激的影响Fig.6 Effect of alcohol extract from penis cervi on heat stress of C.elegans

表3 鹿鞭提取物对线虫热应激的影响Table 3 Effect of penis cervi extract on heat stress of C.elegans

2.6 氧化应激实验

在百草枯致氧化损伤模型中，HC和MC低、中剂量组（0.5、1.0 mg/mL）可显著提高线虫的平均生存时间（P＜0.05）；高剂量组极显著提高线虫平均生存时间，分别提高41.04%和31.45%（P＜0.01）（图7和表4）。可见，2种鹿鞭醇提物可增加线虫对百草枯的抵御能力，显著延长寿命，2.0 mg/mL水平，HC对百草枯抵御能力优于MC。

2.7 鹿鞭醇提物线虫体内ROS的影响

活性氧的异常积累可导致机体氧化应激，进而影响线虫寿命。通过2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光染色法测定线虫体内ROS水平，结果显示，鹿鞭醇提物呈浓度依赖性抑制线虫体内ROS的形成（图8）。2种鹿鞭在低中剂量组无显著差异，在2.0 mg/mL水平，HC的ROS清除率为28.67%，明显高于MC组（23.34%）。

2.8 鹿鞭醇提物对线虫抗氧化酶活力和MDA含量的影响

图7 鹿鞭提取物对线虫氧化应激的影响Fig.7 Effects of extracts from penis cervi on oxidative stress of C.elegans

表4 鹿鞭提取物对线虫氧化应激的影响Table 4 Effects of different solvent extracts penis cervi on the oxidative stress of C.elegans

图8 鹿鞭提取物对线虫体内ROS的影响Fig.8 Effect of extracts from penis cervi on ROS in C.elegans

3 结论与讨论

本研究显示，经HC和MC各剂量处理后，线虫寿命值显著提高且呈浓度依赖性；运动能力测试表明，花鹿鞭和马鹿鞭醇提物可显著改善衰老线虫的运动状态，延长热应激和氧化应激状态下线虫平均生存率。因此，2种鹿鞭均可在线虫体内发挥抗衰老活性。

氧自由基理论认为，衰老可能是由于机体正常代谢或受外界环境胁迫时，产生过量活性氧自由基（ROS），导致ROS与抗氧化酶失衡，引起脂质过氧化反应，损伤DAN、蛋白质结构，最终导致细胞凋亡和衰老[23]。经鹿鞭醇提物处理后，线虫可显著改善因百草枯胁迫引起的ROS异常累积，提高SOD、CAT抗氧化酶活力、降低脂质过氧化产物MDA含量。文献报道鹿茸醇取物[24]可显著提高线虫对胡桃醌胁迫的抵御力，提高其抗氧化能力，延长线虫寿命。淫羊藿醇提取物[25]降低衰老小鼠体内ROS水平，提高抗氧化酶活性，其抗衰老机制主要源于抗氧化活性。余甘子提取物[26]可显著提高线虫体内SOD活力，形成氧化保护，提高线虫寿命。因此，鹿鞭醇提物可能是通过提高抗氧化能力，清除活性氧自由基，提高抗氧化酶活性来实现抗衰老活性。这也与鹿鞭醇提物[7]具有提高抗氧化酶活性，降低MDA水平，改善小鼠疲劳状态结果相一致。

2种鹿鞭醇提物可显著提高线虫的寿命值，但对其产卵能力无显著差异，表明鹿鞭在发挥抗衰老作用的同时，对线虫生殖能力无损害，这与橙提取物[27]延长线虫寿命且不损伤生殖能力的结果相一致。饮食限制途经是指保证线虫正常营养状态下，减少多余热量的摄入，通过延迟发育，延缓线虫寿命。吐咽能力为饮食限制途经的常用指标。文献报道海参[28]提取物延长线虫寿命且显著提高其吐咽能力。在本文中，鹿鞭醇提物均未抑制线虫吐咽能力，且在中、高剂量组（1.0、2.0 mg/mL）具有显著促进作用。表明线虫在不断的在摄取含OP50的药物来实现药理活性，而不是由于饮食限制途经。这也与枸杞提取物[29]提高线虫吐咽能力的结果一致。

2种鹿鞭醇提物均可通过提高抗氧化能力，清除线虫体内ROS累积，增强机体应激抵抗力，以实现抗衰老活性的目的，其中2.0 mg/mL HC组线虫在寿命、氧化应激、运动实验测试中均优于MC，表明在一定剂量水平下，花鹿鞭醇提物抗衰老活性大于马鹿鞭醇提物。本研究可为鹿鞭药材的开发利用提供参考，但未对衰老基因相关调控机制深入研究，有待继续探讨。