植物蛋白水解及在热反应肉味基料中应用进展

王羽桐，赵 银，李 健，李 娟，杜文斌，谭 佳，谢建春

（北京食品营养与健康高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京工商大学轻工科学技术学院，北京 100048）

肉味香精为具有肉类风味的食品添加剂，其广泛应用于方便食品、肉制品、调味品等食品中。20世纪80年代，为适应方便面工业的快速发展，以水解植物蛋白（Hydrolyzed Vegetable Protein，HVP）、氨基酸与还原糖热反应制备肉味基料再辅以调香制备的肉味香精，称为第一代肉味香精，特点是“非肉源”、香气浓郁、价格低廉，但缺少真实肉味道。90年代起，“非肉源”肉味香精逐渐被取代，开始以水解动物蛋白（Hydrolyzed Animal Protein，HAP）经热反应制备肉味基料，然后辅以调香制备肉味香精，产品满足了人们对肉味道的需求，此称为第二代肉味香精。在此基础上，为进一步得到不同种动物肉的特征风味，人们在热反应体系中又添加调控氧化的动物脂肪制备热反应肉味基料，由此技术制备的肉味香精被称为第三代肉味香精[1]。热反应制备肉味基料中，美拉德反应与脂质氧化反应为形成肉风味的主要反应，且二者之间还发生复杂的交互作用，其中含氨基化合物（主要是半胱氨酸或含半胱氨酸的肽）与还原糖发生美拉德反应产生的含硫化合物是肉香味主要来源，肉类脂质（包括磷脂、甘油酯）氧化降解产生的小分子醛、酮等羰基化合物对特征肉香味有贡献，而小分子羰基化合物参与美拉德反应还可生成新的杂环化合物，从而使肉香味丰富浓郁，像真性好[2]。

图1为从1980到2019年检索的国内外与HVP和热反应肉味香精制备有关的文献报道趋势，其中“非肉源”指仅涉及HVP风味及以HVP为主要原料（不含HAP）制备热反应肉味香精的文献，“肉源”为制备热反应肉味香精时不仅涉及到HVP还涉及到HAP的文献。

由图1可知，有关HVP风味与仅以HVP为原料制备肉味基料的论文，国外出现较早，并于2009年后数量迅猛增长，而专利数量一直不多。国内1996年后论文开始出现，直到2016年，论文数量一直处于迅猛增长趋势，2017～2019年迅速下降；而专利数一直处于上升趋势。有关采用肉水解物为原料制备肉味基料的论文，国外报道一直较少，国内报道较多。国内在2005～2007年论文数量达到峰值，2013后趋于平稳，而专利数在2011～2013年数量达到峰值，2013年后迅速下降。

总之，与国外相比，我国HVP的开发利用起步较晚。近年来国内外有关HVP风味及非肉源肉味基料的专利数迅速增长，与素食食品的兴起有一定关系。

近年来采用素肉香精制备的仿肉食品，如素肉饼、素肉香肠等，由于低盐低脂低胆固醇且加工过程安全，受到素食主义者与患有“三高”类健康疾病的人喜爱。HVP由植物蛋白经酸法或酶法水解制备，生产成本低而富含多种氨基酸、多肽，是制备素肉类肉味香精的主要原料。然而，现阶段制备的素肉香精产品存在仅能部分模拟真实肉风味的问题，故本文针对迄今国内外关于HVP制备工艺，和不采用动物性原料，仅以HVP为原料制备热反应肉味基料的工艺研究现状及检测的风味物质进行概述，为研发新型的仅以植物蛋白为原料制备肉味基料的工艺提供借鉴。

图1 国内外HVP风味及HVP在制备肉味香精中应用的文献发展趋势Fig.1 Trend of literature related to HVP flavor and HVP used in preparation of thermal reaction meat flavorings in the world

1 HVP制备工艺

植物蛋白种类繁多，营养丰富，易被人体消化吸收，是理想的蛋白质来源。植物蛋白来源广泛，可分为水果、蔬菜、菌类、粮食类，其中易获得且蛋白质含量高的植物蛋白种类更受青睐。目前国内外主要以大豆、小麦等粮食类蛋白为热反应肉味基料制备原料。为降低成本，一般选用大豆榨油后剩余的豆粕、小麦脱皮后剩余的麦麸等初加工副产物进行水解以制备大豆HVP和小麦HVP。

常用HVP包括酸水解法制备的酸解植物蛋白（Acid Hydrolyzed Vegetable Protein，aHVP）与酶水解法制备的酶解植物蛋白（Enzymatic Hydrolyzed Vegetable Protein，eHVP）。酸法比酶法水解度高，如Aaslyng等[3]比较酸法和酶法水解大豆蛋白，得出酸法水解度为78.2%，酶法为65.5%。酸解法得到的HVP游离氨基酸含量往往高于酶解法，但肽含量小于酶解法[4]。为便于贮藏，HVP溶液常采用喷雾干燥法制备成粉[5]。喷雾干燥工艺条件对HVP产品风味有影响，喷雾干燥过程中还可添加其他原料调整HVP产品的风味[6]。也可采用冷冻干燥法将HVP溶液脱水成粉状，冷冻干燥与喷雾干燥的产品风味有明显不同[7-8]。近年来碱水解植物蛋白作为新水解方法得到研究，冯云龙等[9]使用浓度为2%的NaOH水解葵花籽粕蛋白，但所得HVP碱味较重不利于直接使用。微生物发酵法也可将植物蛋白水解，如Aguirre等[10]证实乳酸菌可以水解大豆蛋白，不同种类乳酸菌水解大豆蛋白的氨基酸含量相差较大，目前机理尚待研究。

1.1 酸法水解植物蛋白工艺

酸法水解植物蛋白，最早出现于1866年的瑞士，我国生产开发始于20世纪90年代初[4]。目前主要用盐酸或硫酸制备aHVP。酸解法中蛋白种类、酸的浓度、固液比、水解时间等条件对水解度有影响。郭青雅等[11]以水解度和谷氨酸含量为指标研究水解工艺，得出开始时盐酸浓度增大及酸解时间增长，水解度提高，当盐酸浓度或酸解时间增加到一定水平时，水解度变化不大，而高浓度长时间酸解会破坏氨基酸结构。华婧等[12]以20%浓硫酸溶液溶解适量大豆蛋白，110 ℃水解8 h条件下进行实验，发现采用不同固液比得到的水解度均较高，增大固液比对水解度影响很小，故选择较小固液比进行水解，以减少酸的用量并使水解液风味较好。Jarunrattanasri等[13]采用0.5 mol/L HCl溶液水解米糠蛋白，95 ℃条件下水解12 h，水解度为13.3%；水解36 h的水解度为24%；表明随酸解时间的增长，水解度增大。表1汇总了报道的酸法水解不同植物蛋白工艺。

表1 文献报道的酸法水解植物蛋白工艺Table 1 HVP preparation technologies by acidolysis of vegetable protein reported in the literature

酸解植物蛋白法历史悠久，成本低水解度高，但易破坏氨基酸与多肽的结构，且存在产生氯丙醇的食品安全问题。故近年来报道的多为HVP酶解法水解工艺。

1.2 酶法水解植物蛋白工艺

常使用已经工业化的蛋白酶对植物蛋白进行酶解。按照作用位点，蛋白酶可分为内切酶和外切酶。根据其来源不同可分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶三大类。如表2所示，其中微生物蛋白酶种类丰富，来源广泛。利用遗传工程技术使微生物菌株获得改良，增加蛋白酶种类，可使酶解植物蛋白技术不断得到发展[4]。文献报道的酶法水解植物蛋白工艺见表3。

表2 植物蛋白水解常用酶种类Table 2 Enzymes used for hydrolysis of vegetable proteins

不同酶的水解条件不同。酶解条件一般为温度45～65 ℃，pH 5.0～9.0，酶解时间2～24 h。往往随加酶量升高水解度开始增大，一定加量后水解度趋于平缓。加酶量过高时，水解产物的风味还会受到酶异味的影响。随时间的延长水解度增加，达到最大值后，水解度会与时间呈负相关。底物浓度过高时，因体系粘稠，底物与酶接触不充分，水解度会降低。由于酶易受环境影响失活，选择最适pH下酶解，水解度高。

目前，以小麦、花生、大豆、菜籽等植物蛋白为原料的酶解工艺报道较多，其他蛋白如玉米、蘑菇等蛋白的酶解工艺也有些研究。同一植物蛋白采用不同酶，其较佳酶解条件及获得的水解度及酶解产物组成不同。武彦文等[44]使用木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、复合胰酶、复合蛋白酶水解大豆粕蛋白，结果表明复合胰酶水解度最高。Kim等[49]的实验结果也证实这一点，并报道最佳水解条件为：复合胰酶2%，固液比1:8，50 ℃下酶解24 h。Kong等[20]酶解小麦蛋白，比较碱性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶的酶解效果，发现采用碱性蛋白酶时蛋白质回收率和水解度显著高于采用其他酶，碱性蛋白酶酶解的最佳条件为：蛋白溶液5%，酶与底物比1:100，60 ℃，pH 8.6，酶解6 h。刘英丽等[36]酶解高温花生粕粉，比较碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解效果，发现采用碱性蛋白酶时水解度和DPPH清除率（衡量抗氧化性能的参数）均最高，最佳条件为：蛋白7%，酶加量2%，65 ℃，pH 8.0，酶解4 h。

采用酶法制备HVP存在酶解液有苦味问题。蛋白质水解过程中，部分疏水基团随着蛋白结构的改变而暴露，从而酶解液出现苦味。内切酶如风味蛋白酶，从肽链中间特殊作用位点进行切断，而外切酶从多肽链的末端切断。具有苦味的多肽称为苦味肽，外切酶使苦味肽彻底降解为氨基酸后，苦味可消失，故使用外切酶可降低酶解液的苦味。仅使用外切酶时水解度低，采用外切酶与内切酶结合的复合酶解法进行酶解，可达到降低产物的苦味又不损失水解度。复合酶解包括外切酶与内切酶二者分步酶解及二者同

时酶解两种方式。张继贤等[70]酶解鹰嘴豆蛋白，首先进行碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等的单一酶解，再采用碱性蛋白酶与风味蛋白酶进行复合酶解，获得最佳水解条件为：第一步，蛋白浓度1%，碱性蛋白酶2000 U/g，55 ℃，酶解2.5 h；第二步，使用风味蛋白酶4000 U/g，55 ℃，酶解3 h。刘佳等[41]发现使用风味蛋白酶酶解牛肝菌时鲜香味增加，苦味降低，然后考察了风味蛋白酶分别结合木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶的复合酶解效果，得出较佳条件为：同时添加10 万U/g风味蛋白酶和80 万U/g木瓜蛋白酶，加量0.3%；料水比1:7（g /mL），50 ℃，pH 6.0，酶解4 h，此时水解度较高及酶解液的风味较好。此外，Zhang等[57]研究表明，在水解过程中外加谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸可增加鲜味、降低苦味，外加精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸具有更高的抗氧化活性。

表3 文献报道的酶法水解植物蛋白工艺Table 3 Reported HVP preparation technologies by enzymatic hydrolysis of vegetable protein in literature

为了克服酶法的水解度低及酸法产生氯丙醇的缺陷，酸法与酶法二者结合制备HVP具有更好前途。例如，史亚静等[83]选用酸酶结合法制备安全、利用率高的水解液，第一步：脱脂大豆粕料液比为1:10，木瓜蛋白酶0.15%，60 ℃，酶解1 h；第二步：风味蛋白酶0.15%，50 ℃，酶解2 h，此时水解度为10.46%；第三步：3 mol/L盐酸，60 ℃，酸解1 h，获得水解度较高34.87%、氯丙醇含量较低（0.3 mg/kg）的水解液。

2 HVP中检测的风味物质

HVP风味主要由其所含的氨基酸与还原糖发生美拉德反应及脂肪酸发生氧化降解反应产生。表4列出了迄今为止从aHVP与eHVP中检测的主要风味物质，共99种化合物，包括含硫化合物9种，含氮杂环化合物22种，含氧杂环化合物9种，醛类16种，酮类8种，醇类6种，酸类15种，酯类4种，酚类6种，其他类4种。其中，有31种化合物采用气相色谱-质谱联机（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）分析检测到，68种化合物采用气相色谱-嗅闻法（Gas Chromatography-Olfractometry，GC-O）检测到。

表4 HVP中检测的风味物质Table 4 Flavor compounds found in HVP

续表 4

根据稀释法GC-O （Aroma Extract Dilution Analysis/GC-O，AEDA/GC-O）分析的稀释因子（Flavor Dilution Factor，FD）或根据计算得到的化合物气味活性值（Odor Activity Value，OAV）可确定挥发性风味化合物对总体香气的贡献。Lopez等[39]采用稀释法GC-O分析未成熟的白色双孢蘑菇蛋白酶解物，发现2-乙酰基噻唑、3-(甲硫基)丙醛、2,5-二甲基-4-羟基-3（2H）呋喃酮、3-羟基-4,5-二甲基-2（5H）-呋喃酮、苯乙醛、邻氨基苯乙酮、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、香草醛FD值较大，为重要风味化合物。Kaewka等[5]GC-MS分析酸解的米糠蛋白HVP，发现OAV≥1的包括糠醛、2-甲氧基-6-甲基吡嗪、己醛、香草醛，为重要风味化合物。

水解的蛋白种类对HVP风味有较大影响。Aaslyng等[54]发现2-乙酰基呋喃在酸解大豆蛋白中的含量（1215 ng/100 mL）显著高于酶解大豆蛋白（20 ng/100 mL），而2-甲氧基苯酚相反，酶解大豆蛋白（1968 ng/100 mL）显著高于酸解大豆蛋白中的含量（116 ng/100 mL）。脂肪醛、酮、醇、酸、酯来源于脂质氧化反应，植物蛋白中的甘油三酯水解生成脂肪酸，经自动氧化与热氧化产生小分子化合物。其中，醛类是主要的氧化产物，如亚油酸氧化产生的（E,E）-2,4-癸二烯醛，可进一步分解生成对风味有重要影响的乙醛、戊醛等短链脂肪醛和（E）-2-辛烯醛等烯醛[90]。2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等带有支链的醛和苯乙醛分别来源于缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的Strecker降解反应[7]，对HVP风味往往有重要贡献，而2-甲基丙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、苯乙酸为上述醛的氧化产物。由于酸解法温度高，意味着酸解HVP中产生的支链醛或苯乙醛的含量可能高，但实验表明两种水解方法产生的含量并无显著差异，可能由于pH等其他反应条件也会有影响造成[54]。直链酮如2-丁酮、6-甲基-2,4-庚二酮由脂质氧化降解反应产生，但3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二酮由美拉德反应中糖降解产生。醇类化合物中，苯乙醇为苯乙醛还原产物，其他化合物由脂质氧化降解反应产生，如具有蘑菇风味的1-辛烯-3-醇主要由亚油酸氧化降解产生[91-92]。内酯类化合物一般具有水果香、甜香，由γ-羟基酸环化脱水形成[92]。酚类化合物和其他化合物可能是由酶或植物蛋白带入，其中原料中含有的木质素或酚酸类物质发生降解可产生酚类化合物。

3 HVP在热反应肉味基料制备中应用

3.1 热反应肉味基料制备工艺

表5汇总了文献报道的以HVP为原料制备热反应肉味基料工艺。原料配方及热反应条件对热反应肉味基料风味有重要影响。刘立新等[100]通过正交试验得出，温度与时间对热反应基料风味的影响均为开始时呈正相关，随着温度升高或反应时间延长变成负相关。毛善勇等[14]采用响应面法设计实验得出温度过高时热反应产生烧焦味和糖浆味，而反应液pH升高到8时产生氨味。Chen等[23]研究发现，HVP进行脱酰胺处理可使热反应肉味基料风味更丰富。彭秋菊[93]通过正交试验发现HVP粉与酵母抽提物对烤肉风味影响相近，但两种原料的热反应工艺配方有明显差别，在反应体系中添加黑胡椒粉、蒜粉、孜然粉等香辛料，可使烤肉味浓郁，风味饱满。曾庆祝等[101]采用花生粕蛋白先发酵后酶解的方法，提高蛋白利用率的同时，使制备的肉味基料风味醇厚鲜香。冷云等[95]测定得出酶解大豆蛋白中含有大量苯丙氨酸、亮氨酸、精氨酸，又补充半胱氨酸、硫胺素、维生素C进行热反应，使猪肉香味纯正浓郁。

表5 热反应肉味基料制备工艺Table 5 Reported preparation technologies of thermal reaction meat stock

由表5可知，由于酶法水解植物蛋白产物温和，氨基酸和多肽保留较好，制备热反应肉味基料时，多采用了eHVP。eHVP是氨基酸与多肽的混合体系，eHVP对制备肉味基料的影响与其水解度存在密切关系，水解度不同，所含的氨基酸和多肽种类和含量不同，热反应后风味不同。张继贤等[98]研究表明，不同水解度的酶解鹰嘴豆蛋白液为原料，制备的热反应肉味基料风味差异较大，其中水解度在23.03%～26.02%范围内的酶解液制备的肉味基料香气丰富，肉味浓郁。eHVP中肽的分子量分布也有影响，一般分子量越小，肽链越短，反应程度越高，挥发性化合物的数量越多[31]。Yu等[59]使用豆粕酶解物制备热反应肉味基料，发现使用分子量为1～3 kDa的多肽组分制备的肉味基料鲜味和肉味最佳，其次为＜1 kDa多肽组分。

此外，受热条件下酶解液自身产生的风味物质对热反应肉味基料风味的影响不容忽视。Lotfy等[40]对比了微波加热与传统加热时酶解物的风味差异及影响，结果显示传统加热法检测出44 种化合物，而微波加热法仅检测出28种，而某些关键肉味化合物如2-甲基-3-呋喃硫醇，通过传统加热法检测峰面积占10.07%，小于微波加热法（13.37%）。

总之，已报道的热反应工艺配方主要为以HVP为主体的美拉德反应前体物构成，发生热反应时仅产生基础肉香味，但无特征肉风味或特征肉风味很弱。在真实的肉类风味中，肉中动物脂肪氧化产生大量醛酮类羰基化合物，这些羰基类化合物构成了不同种动物肉的特征风味。因此，人们采用适当添加油脂的方法提升特征肉风味，如刘立新等[100]以酸解植物蛋白为原料，添加葵花籽油，制备类似牛肉香味。植物油与动物脂肪在脂肪酸组成及一些微量组分（如植物油中含有多酚类）方面有较大差别，故如何将植物油定向氧化获得类似于动物脂肪的氧化产物，是制备具有特征性肉香味的肉味基料的关键所在。另外，植物油还含有大量具有“青草味”的物质（如己醛），因此，如何使“青草味”减弱甚至消失是植物油定向氧化过程中要解决的首要问题[102]。

3.2 热反应肉味基料检测到的风味物质

表6汇总了迄今文献报道的以HVP（主要为eHVP）为主要原料制备的热反应肉味基料中风味物质，共117种化合物，包括含硫化合物25种，含氮杂环化合物20种，含氧杂环化合物9种，醛类17种，酮类9种，醇类12种，酸类12种，酯类5种，酚类3种，其他类5种。GC-MS鉴定出74种化合物，GC-O鉴定出43种化合物。

表6 热反应肉味基料中检测到的风味物质Table 6 Flavor compounds found in thermal reaction meat stock

续表 6

续表 6

与表4相比，由于热反应时添加了含硫氨基酸或硫胺素，造成检测出的含硫化合物种类数显著增加。含硫化合物对肉类风味有重要贡献，往往气味阈值低，GC-O检测时有较高FD值。其中3-甲硫基丙醛和二甲基二硫醚来源于蛋氨酸Strecker醛降解[40,68,74]，2-甲基-3-（甲基二硫基）呋喃，由半胱氨酸的美拉德反应产生的2-甲基-3-呋喃硫醇再与甲硫醇反应形成[105]。含氮杂环化合物由美拉德反应产生，脯氨酸与还原糖反应可产生2-乙酰基-1-吡咯啉[8,40]。吡嗪类化合物具有烤香，坚果香，可通过两分子α-氨基酮缩合形成，且这种缩合反应碱性pH下易于进行[55,68,78]。崔春等[4]研究表明，aHVP由于主要由氨基酸组成，制备的肉味基料肉味突出；而eHVP含有游离氨基酸和大量的多肽，制备的肉味基料烤香明显，这与研究发现[106]的氨基酸组分对于产生含硫化合物贡献较大，而短肽发生美拉德反应易产生吡嗪类化合物的研究结论相一致。

含氧杂环化合物，如2-乙酰基呋喃、糠醛、甲基麦芽酚，普遍具有焦糖香。乳糖是2-乙酰基呋喃的最优前体[78]，糠醛可由戊糖的Amadori产物通过1,2-烯醇化及环化反应产生[78]。甲基麦芽酚可在麦芽糖与氨基酸的加热过程产生[7]。由于热反应肉味基料制备中添加了还原糖，含氮杂环、含氧杂环、Strecker醛等产生于美拉德反应的风味物质的含量往往比HVP自身增加，如Aaslyng等[3]对比eHVP热反应前后风味物质，发现吡嗪类化合物（如三甲基吡嗪）含量显著上升。

4 结论

本文综述了HVP制备工艺及以HVP为原料制备热反应肉味基料工艺的研究现状及检测的风味化合物。植物蛋白来源广泛、价格低廉，以HVP为原料制备的“非肉源”热反应肉味基料不仅风味复杂多样，且营养健康、绿色环保，可在如今人口激增带来的压力下改善资源短缺及食品安全的问题，符合当今食品工业发展趋势。未来发展中，通过深入挖掘肉味同源理念中肉香味的形成机理，以植物蛋白水解物（如HVP）构造含有重要肉香前体的食品体系，通过热反应和调香制备植物性肉味香精，将成为香精香料和食品行业的重要方向。