液相色谱和液质联用法分析食品中苯并咪唑类药物残留的研究进展

2021-06-18朱姗姗连思雨李丽娜衣恒磊郑振佳

食品工业科技 2021年10期

朱姗姗，连思雨，李丽娜，衣恒磊，王丹，郑振佳，吴澎,

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安 271018；2.莱阳市动物疫病预防与控制中心，山东烟台 264000；3.龙大食品集团有限公司，山东烟台 265200）

苯并咪唑类（Benzimidazoles，BMZs）化合物是一类苯环和咪唑的4位和5位取代基稠合而成的苯并杂环化合物[1]，常见的苯并咪唑类化合物结构式如图1，其母核结合不同的官能团可以形成不同功能的物质[2]。BMZs广泛用于农业、水产养殖和家禽中，不仅可以用于动物驱虫还可以用于植物杀菌。常用的苯并咪唑类兽药包括阿苯达唑（ABZ，Albendazole）、芬苯达唑（FBZ，Fenbendazole）、氟苯达唑（FLU，Flubendazole）、甲苯达唑（MBZ，Mebendazole）、噻苯达唑（TBZ，Thiabendazole）以及三氯苯达唑（TCB，Trichlorobendazole）等。常用的苯并咪唑类农药（杀菌剂）主要包括苯菌灵（BEN，benomyl）、多菌灵（CBZ，carbendazim）和甲基硫菌灵/甲基托布津（TM，thiophanate-methyl）等。苯并咪唑类药物及其代谢物具有致畸性、致突变性及胚胎毒性[1]，过度或违规使用会导致BMZs及其代谢物在体内蓄积，通过食物链的传递影响身体健康，引起腹泻、贫血以及坏死性淋巴结肿大等[3]。因此，对食品中BMZs及其代谢物的有效准确的检测具有重要意义。美国、中国、日本以及欧盟等国家将其列为重要检测对象并制定了最大残留限量（MRL）如表1所示。

目前检测分析苯并咪唑类物质的方法主要包括电化学法、荧光光谱法、分光光度法、毛细管电泳法、免疫分析法以及色谱分析法[4-9]。食品中苯并咪唑类物质的检测方法以色谱分析法为主，但该类物质挥发性较差难以直接通过气相色谱法测定[10]，液相色谱及液相色谱质谱法为检测食品中苯并咪唑类物质的主要方法。本文介绍了苯并咪唑类药物的分析检测现状，总结了2016至2020年间具有代表性的色谱分析的应用，从样品前处理与检测分析两个方面分别介绍技术方法以及应用实例，同时对苯并咪唑类物质的残留检测分析方向进行展望，以期为进一步提高食品中苯并咪唑类物质的检测水平提供参考。

1 苯并咪唑类药物及其代谢产物

苯并咪唑类兽药的主要代谢部位为肝脏，其药物残留的主要部位为肝脏和肾脏，在肌肉和脂肪组织中残留较少[10]。苯并咪唑类药物进入动物机体经过肝脏代谢产生多种代谢产物，部分代谢物的毒性增强，如羟基甲苯达唑（MBZ-OH）比MBZ具有更大的胚胎毒性[10-11]。为准确检测食品中的苯并咪唑类物质的残留量，需同时对苯并咪唑类药物的代谢物进行分析。常见的几种苯并咪唑的基本信息见表2，其中残留标志物根据2019年发布的《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650-2019）以及《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763-2019）进行整理。

图1 常见的苯并咪唑类化合物Fig.1 Common benzimidazoles

表1 各国及地区对苯并咪唑类兽药的最大残留限量规定Table 1 Maximum residue limits for benzimidazole veterinary drugs in various countries and regions

表2 苯并咪唑类化合物的基本信息Table 2 Basic information of thebenzimidazoles compound

2 样品前处理技术

苯并咪唑类物质及其代谢物的分析属于痕量分析，因此使用高效的样品前处理方式进行富集是多残留检测分析的关键[10]。常用的前处理方式有QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）、固相萃取（Solid phase extraction，SPE）、液-液萃取（Liquid-liquid extraction，LLE）和分子印迹（Molecular imprinting technique，MIT）等技术。

2.1 QuEChERS技术

QuEChERS技术于2003年由Michelangelo Anastassiades首次提出用于提取水果和蔬菜中的农药残留[17]，传统的QuEChERS方法因其分析时间长、溶剂消耗大以及成本高且不适合从复杂样品基质提取目标物等缺点不断被改良，其相关改进如图2所示。由最初的非缓冲版本演变为柠檬酸盐版本（硫酸镁和氯化钠）和乙酸盐版本（硫酸镁和乙酸钠）两种官方方法[17-18]。基于其多功能性和绿色简便的特性，被广泛应用于食品、医药以及环境科学等不同的领域，且改良的QuEChERS技术更有利于农药兽药的检测分析[17]。Zhang等[19]利用改良的前处理技术结合UPLC-Q-TOF-MS对蜂蜜中的苯并咪唑等物质进行检测，其改进包括：酸水解并用柠檬酸和Na2HPO4沉淀蛋白质；用乙酸酸化的乙腈萃取；用氯化钠/无水硫酸钠代替乙酸钠/无水硫酸镁盐析；用NH2柱作为基质固相分散萃取的分散剂，无需进行固相萃取步骤，结果显示在研究样品质量对回收率的影响时，使用1 g蜂王浆样品，90种分析物的最佳回收率可达71.4%～121%，提取效果较好。Jean等[20]利用虾壳废料中的壳聚糖作为吸附剂结合液质联用技术检测不同牛奶中包括苯并咪唑在内的兽药残留，结果显示回收率为62%～125%，高于使用传统吸附剂的方法且壳聚糖作为吸附剂有利于资源的循环利用。

图2 QuEChERS技术的相关改进[18]Fig.2 Related improvements of QuEChERS technology[18]

近年来根据基质性质改良QuEChERS技术中填料的用量和种类，以及将QuEChERS技术与其他前处理方法结合，进一步提高了QuEChERS技术提取净化的效果。Petrarca等[21]利用QuEChERS技术与分散液-液微萃取（DLLME）相结合取代了传统的d-SPE结合气质联用技术检测婴儿食品中包括苯并咪唑类药物在内的农药残留，QuEChERS-DLLME和QuEChERS-d-SPE技术的LOQ分别为0.01～0.05和0.05～0.1 mg/kg，前者更为灵敏。QuEChERS适合于多类化合物的分析，因此该技术在苯并咪唑类物质的检测上具有广阔的前景。

2.2 固相萃取技术

固相萃取技术原理是通过固体吸附剂保留目标物，使其与其它基体以及干扰物分离，然后进行淋洗、洗脱步骤进而使目标物分离富集[22]，其典型操作过程如图3。SPE技术根据固体吸附剂（萃取柱）以及提取试剂的不同而有不同的萃取效果，常用的萃取柱有C18柱、HLB柱、MAX柱以及MCX柱等。基于SPE技术各个阶段的小型化、自动化以及不同吸附材料改良的固相萃取技术包括：固相微萃取（SPME）、分散固相萃取（d-SPE）、磁性固相萃取（MSPE）、分子印迹固相萃取、基质固相分散萃取（MSPD）以及在线固相萃取等[23-24]。

图3 典型SPE操作流程图[25]Fig.3 Typical SPE operation flowchart[25]

吸附剂的改良一直是固相萃取技术的研究重点。Wang等[26]利用碳纳米纤维（CNFs）固相萃取（CNFs固相萃取程序见图4）耦合HPLC测定水果、蔬菜和果汁中的苯并咪唑类农药，结果表明，该前处理方法无需调节样品溶液的pH以及离子强度，经过五次吸附-解吸循环的CNFs仍保持对目标分析物的高回收率（回收率＞90%），且获得的CBZ和TBZ的LOD低于通过其他样品预处理方法[27]获得的LOD，回收率为96.1%～103.5%，相对标准偏差百分比（RSD）为1.27%～3.90%。Zhao等[28]利用共价三嗪框架（CTF）作为混合模式磁性固相萃取吸附剂结合HPLC检测蔬菜、水果和果汁中CBZ和TBZ的残留，当吸附剂量为20 mg、提取时间为2 min时可以取得最高的提取效率，与其他小柱技术相比，MSPE方法使用的吸附剂量更少，提取时间更短且CTF重复6次后分析物的萃取回收率没有明显变化，这突出了其良好的再生性能，回收率为80.2%～115.1%，RSD为6.0%～11.4%。

图4 CNFs固相萃取程序[26]Fig.4 CNFs solid phase extraction procedure[26]

Zhu等[29]利用基于在线固相萃取结合LCMS/MS测定牛奶中包括13种苯并咪唑的残留，分析的总时间（包括萃取，淋洗和洗脱阶段）为39 min，平均回收率为63.1%～117.4%，RSD为3.3%～17.6%，该方法可以用作快速测定牛奶中多种兽药残留的有效方法。吴韵等[30]利用巯基聚合整体柱固相微萃取结合液质联用技术对食品中8种痕量苯并咪唑进行检测，结果表明，对8种苯并咪唑阿苯达唑亚砜（ABZ-SO）、奥芬哒唑（OFZ）、TBZ、CBZ、MBZ、FBZ、ABZ和FBZ的最大萃取容量分别为2518、11520、3520、11758、11917、12084、12237和12476 ng，表现出极强的吸附能力，且同一根巯基固相微萃取柱可重复使用200次以上。Rizzetti等[31]利用固液萃取结合分散固相萃取净化，通过中心复合设计对不同的吸附剂进行了测试和优化，最后通过UHPLCMS/MS进行分析检测牛组织中兽药残留，结果表明该方法比传统SPE更简便、快速和便宜。

传统的固相萃取技术存在萃取净化效果较差的问题，但通过利用新型纳米材料、石墨烯、氧化石墨烯以及分子印迹聚合物等吸附性能较好的物质作为吸附材料以及与其它方法相结合，可以使固相萃取技术的定向富集能力得到进一步提高。

2.3 液-液萃取技术

液-液萃取技术是利用目标分析物在液相间的溶解度不同而进行分离萃取的技术。随着分析检测技术的不断提高开发了许多新型的液液萃取技术如：盐析辅助液液萃取（SALLE）、分散液液微萃取（DLLME）、单滴微萃取（SDME）、中空纤维液相微萃取（HFLPME）[32-33]，其中三种液液微萃取流程图如图5。近几年液液萃取技术结合固相萃取进行样品处理的方式也取得了较好的效果[34]。

图5 三种液液微萃取流程图[35]Fig.5 Flow chart of three liquid-liquid microextraction[35]

Carmen等[36]利用盐析辅助液液萃取技术结合毛细管液相色谱对牛奶中的16种苯并咪唑类物质进行检测，结果表明三种不同类型的奶制品回收率均大于79.1%且RSD低于8.9%，该前处理方法更加经济高效、绿色简便，有利于同时快速萃取多种苯并咪唑类物质。Piatkowska等[34]采用液液萃取技术与固相萃取技术联用结合液质联用检测鸡蛋中包括20种苯并咪唑在内的120多种物质。该前处理方法先利用液液萃取技术沉淀鸡蛋中的蛋白质，然后通过固相萃取技术去除磷脂等其他基质，20种苯并咪唑的回收率为84%～105%。Teglia等[37]利用基于空气辅助的有机液滴悬浮固化分散液-液微萃取技术（AA-DLLME-SFO）结合液相色谱检测鸡蛋中包括苯并咪唑在内的兽药，该方法比较了AA-DLLMESFO与DLLME两种样品前处理方式，使用AADLLME-SFO时ABZ的回收率为81.9%～85.4%，而使用DLLME时ABZ的回收率为54.4%～57.6%。AA-DLLME-SFO更适合作为样品前处理方法用于苯并咪唑类物质的检测。Asadi等[38]利用基于注射器到注射器的有机液滴悬浮固化分散液相微萃取技术（SS-DLPME-SFOD）结合高效液相色谱法对ABZ和TCB进行检测（过程如图6），与SPME-HPLC等其他微萃取技术进行比较[39]，结果显示，该方法的LOD为0.02～0.06 μg/L，而SPME-HPLC及其他方法的LOD为0.21～12.5 μg/L。

随着萃取剂、分散剂种类选择范围扩大，微萃取形式的不断发展以及各种辅助手段的应用，液液萃取技术在样品前处理方面越来越成熟，而开发安全低毒、绿色环保的新型萃取剂与分散剂，提升其自动化水平，与其他前处理方式相结合等操作，将更适合苯并咪唑类物质的萃取富集。

2.4 分子印迹技术

分子印迹技术于20世纪中期开始发展，是指制备对特定的目标分子具有特异识别位点的聚合物的过程[40]。可以通过合适的交联剂和模板周围的功能单体的共聚或共缩合来定向构建分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers, MIPs），制得的MIPs具有压印空腔或结合位点且在尺寸、形状和官能团方面与模板互补[41-42]。因此，MIPs具有识别特异性、应用通用性和结构可预测性三个代表性特征。

图6 SS-DLPME过程[38]Fig.6 SS-DLPME procedure[38]

Chen等[43]利用微波辅助RAFT聚合磁性分子印迹聚合物（MMIP，其制备过程如图7所示）并选择性识别苹果中噻菌灵、氟苯达唑、多菌灵以及2-氨基苯并咪唑四种苯并咪唑类残留物，结果显示回收率为62.1%～92.1%，MMIP聚合过程在1 h内完成，与传统的热自由基聚合反应相比，大大缩短了反应时间，且使用MMIP重复相同的吸附-解吸循环六次后，吸附能力仍可保持在96.4%，这表明生成的MMIP可以使用六次。LIANG等[44]利用基于β-环糊精功能化多壁碳纳米管的分子印迹整体柱选择性识别柑橘中的苯并咪唑残留，结果显示，该色谱柱对TBZ、FBZ和CBZ具有很高的亲和力，富集因子分别达到23.0、9.4和17.8，且与其他样品前处理方法进行比较该方法的检测限低于大多数其他样品制备方法。

图7 微波辅助RAFT 聚合制备TBZ-MMIPs的示意图[43]Fig.7 Schematic diagram of TBZ-MMIPs prepared by microwave-assisted RAFT polymerization[43]

MIT作为一种新兴的样品前处理方法被广泛关注。虽然在提取选定的目标物上表现出很大的优势，但由于其聚合物的制备过于复杂且耗时较多，在目前追求绿色简便以及可持续的趋势下应用相对偏少。但该方法十分有利于目标物的富集，因此有必要探索新型材料以及制备合成技术生产出具有更高选择性、容量和亲和力的MIPs。

3 检测分析方法

常用的液相色谱分离主要以正相色谱（NPLC）、反相色谱（RPLC）、亲水色谱（HILIC）以及离子色谱（IC）为主，其中多种色谱分离模式关系图见图8[45]。Vousdouka等[46]利用离子对液相色谱法对发酵乳中的芬苯达唑残留进行检测，结果显示，LOD为3.0～8.7 μg/kg，LOQ为9.9～20.9 μg/kg且回收率为79.8%～88.8%，RSD为6.3%～11.0%，符合欧盟的要求。HILIC与质谱联用适合分析高度亲水和极性的化合物[47]，已被确立为RPLC的一种有价值的补充方法[48]。Dasenaki等[49]利用HILIC串联质谱法测定牛肌肉中包括10种苯并咪唑类物质在内的76种兽药残留结果显示，苯并咪唑类物质的CCα为6.5～252 μg/kg，CCβ为11～269 μg/kg，已成功应用于实际的牛肉样品的测定。

图8 多种色谱分离模式关系图[45]Fig.8 Relationship between multiple chromatographic separation modes[45]

液相色谱串联三重四极杆质谱（QqQ）的使用提高了对多残留目标物同时分析的能力。表3总结了2016～2020年液相色谱以及液相色谱串联三重四极杆质谱在检测苯并咪唑上的典型应用，由表可以看出近五年检测食品中苯并咪唑的前处理方法主要为固相萃取和QuEChERS，其中更多采用改良传统的前处理方式以适应不同样品基质和目标物的检测，在多残留分析时改良的QuEChERS技术是首选的前处理方法，在当前绿色化学的趋势下QuEChERS技术也将是以后研究的首选方法。色谱柱主要以C18为主，其他色谱柱选择相对较少。

苯并咪唑类物质在不同的样品基质中的代谢途径及其代谢产物存在差异，因此进行非目标物质的筛选检测有重要意义。高分辨率质谱（HRMS）可提供精确的质量测量值，全面获取样品中化合物的精确分子质量和碎片离子信息，对非目标物进行筛选[61-62]。常用的HRMS有飞行时间（TOF）、四级杆飞行时间（Q-TOF）、轨道阱（Orbitrap）以及四级杆-轨道阱（QOrbitrap）等质谱。Zheng等[3]利用LC-PIS-MS（PIS前体离子扫描）和高分辨率轨道阱质谱检测猪血中苯并咪唑类物质，检测鉴定了3种BMZ母体药物和18种BMZ代谢物，其中11种首次报道。Pico等[63]利用UHPLC-QqQ-MS/MS以及UHPLC-QTOFMS/MS对水果中包括多菌灵和噻菌灵在内的62种农药进行分析，根据500多种农药及其代谢产物的数据库进行非目标农药识别，使用UHPLC-QqQMS/MS，LOD和LOQ分别为0.2～2.1 μg/kg和0.5～6.3 μg/kg，UHPLC-QTOF-MS/MS的灵敏度稍低，LOD和LOQ分别为0.1～39.1 μg/kg和0.3～119.1 μg/kg。Pang等[64]利用基于TOF精确质量数据库和Q-TOF谱库的液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对水果蔬菜中包括多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂在内的485种农药残留进行筛选检测，发现其中有28类共59种异构体化合物，并检测了全国市场上水果和蔬菜中173种农药残留，残留量低于10 μg/kg（包括10 μg/kg）的农药占54.1%，而残留农药的水平在10～100 μg/kg和100～1000 μg/kg分别占35.9%和9.1%。

Wang等[65]对比了Q-TOF与QqQ表明，在低浓度下QqQ具有更好的精度，Kaufmann等[66]探索Orbitrap技术替代LC/MS/MS技术的能力，测试了包括三种不同基质中约240种分析物的定量性能，结果两种技术的性能相似。由于高分辨质谱仪维护维修费用较高且耗时，因此在单一或少量样品的分析时应多采用普通质谱仪，而在多残留检测以及非目标筛选上高分辨质谱仪发挥着重要作用。其他关于液相色谱串联高分辨质谱在苯并咪唑方面的应用见表4。

液相色谱柱内部直径的小型化也使检测水平进一步提高，由于微型液相色谱的流速比HPLC低约千倍，分析谱带更集中，可以有效减少溶剂的消耗和废物的产生[70]。常用的小型色谱柱有微流液相色谱（μLC）、毛细管液相色谱（CLC）以及纳升液相色谱（nanoLC）等。Carmen[36]利用CLC结合盐析辅助液液萃取对牛奶中的16种苯并咪唑类物质进行检测，结果表明，LOD为1.0～2.8 μg/kg，LOQ为3.2～9.5 μg/kg，该方法更加经济绿色且有利于同时快速检测多种苯并咪唑类物质。Lopez等[57]利用μLC串联QqQ质谱对蜂巢中包括多菌灵和噻菌灵在内的120种农药进行测定，95.8%的化合物LOQ值为5 μg/kg，且样品中仅13%的农药残留受到基质效应的影响。

表3 液相色谱以及液相色谱串联三重四极杆质谱在检测苯并咪唑上的应用Table 3 Application of liquid chromatography and liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry in the detection of benzimidazole

4 结论

随着新型农兽药种类的增多和人们对食品安全重视程度的加强，对检测精准性的要求逐步提高。苯并咪唑类物质作为常用的杀菌剂与驱虫剂，使用过程中往往存在超标问题，因此提高苯并咪唑类物质及其代谢产物的检测水平具有重要意义。总结发现，苯并咪唑类检测趋势主要发展方向有以下三个方面：

一是设备的小型化和自动化。近几年前处理方法在小型化方面进展较大，μLC、CLC以及nanoLC等的研究也日益加强；各种微萃取形式逐渐引入，固相萃取以及QuEChERS技术的自动化水平也有相应提高，全面提高自动化水平应仍然是目前研究的主要方向。

二是前处理吸附剂材料的精准化。石墨烯、纳米材料、共价有机骨架材料以及分子印迹聚合物等材料的引入使净化富集水平提高，聚离子液体、可转换极性的溶剂以及超分子溶剂的使用在苯并咪唑类物质的萃取上是很好的方向。在此基础上，如何进一步提高对苯并咪唑类成分的定向吸附，是今后材料合成的重要发展方向。

三是质谱数据库的完善。近年来高分辨质谱仪在农兽残的分析上应用越来越广泛，该方法基于精准的分子量克服了对标准品的依赖，分析速度和精准度大幅提升。但不同厂商之间的质谱数据库难以共享，因此导致不同研究单位获得质谱信息难以通过数据化处理形成通用性的数据库。因此，探索建立信息更完备的数据库，提高不同品牌之间数据库的融合程度，有利于提高检测数据的精准性。