基于网络药理学预测柴胡、石菖蒲配伍治疗抑郁症的有效成分及作用机制

何伟伟，王豆，李涛，周瑞，闫咏梅

1陕西中医药大学，陕西咸阳 712046；2陕西中医药大学附属医院；3陕西省中药资源产业化省部共建协同创新中心秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育）陕西省创新药物研究中心

抑郁症以显著而持续的心境低落为主要特征，临床表现包括情绪焦虑、睡眠障碍、运动及精神迟缓、自责自罪及有自杀念头等。WHO统计结果显示，全球抑郁症和恶劣心境患者发病率为12.8%，抑郁症已成为全球性的重大医疗疾患［1］。目前对于抑郁症的治疗以化学药物为主，但其治疗效果存在一定局限性，如起效慢、容易反复发作等，还有一些患者存在对抗抑郁化学药物无反应的情况。中医学将抑郁症归于郁病范畴，对于郁病的治疗早在《黄帝内经》中已有论述。近年来，中医药在治疗抑郁症方面显示出了独特的优势。其中柴胡能疏肝解郁、和解表里、升举阳气，具有解热、镇痛、抗抑郁、抗炎、抗肿瘤等作用［2］；石菖蒲主风寒湿痹、咳逆上气、开心孔、补五脏、通九窍、明耳目、出音声，具有抗抑郁、抗癫痫、抗痴呆、改善学习记忆、抗惊厥等作用［3］。柴胡、石菖蒲配伍（柴胡—石菖蒲）在抑郁症的治疗与研究中应用广泛，但目前研究多集中于对柴胡、石菖蒲单体作用成分的分析，而对其联合后多成分、多靶点作用机制研究较少。2020年5月17日—10月21日，本研究运用网络药理学方法探讨柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的有效成分及潜在作用机制，以期为中医药治疗抑郁症研究提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 柴胡—石菖蒲活性成分及作用靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TC‐MSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索柴胡、石菖蒲的有效化学成分，以口服利用度（OB）≥30%、化合物类药性（DL）≥0.18为条件筛选柴胡—石菖蒲活性成分；从平台收集其相关作用靶点，并通过Uni‐prot蛋白数据库（http：//www.uniprot.org）进行蛋白名标准化。采用Cytoscape 3.7.2软件构建柴胡—石菖蒲活性成分—作用靶点可视化网络图，使用Net‐work analyzer工具对柴胡—石菖蒲主要活性成分进行网络特征分析。网络图中圆形节点表示活性成分，菱形节点表示靶点，边表示成分和靶点间的相互关联；Degree表示活性成分与靶点的相互关联的数目，圆形节点面积越大表示Degree值越大，Degree值越大代表该活性成分生物功能越多，重要性越强。

1.2 抑郁症靶点收集和筛选 利用GeneCards数据库（http：//www.genecards.org）、OMIM数据 库（http：//www.omim.org）收集治疗抑郁症的潜在靶点。靶点Score值越高代表该靶点与疾病联系越密切，设定Score大于中位数的靶点为在抑郁症中发挥相对重要作用的靶点。合并2个数据库靶点，删去重复靶点并在Uniprot蛋白数据库进行蛋白名标准化，得到抑郁症靶点。

1.3 柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心靶点分析 通过Venny 2.1.0在线绘图软件将柴胡—石菖蒲成分作用靶点与抑郁症靶点取交集并制作韦恩图，再将两者交集靶点上传到STRING 11.0数据库（https：//string-db.org），生物种类设定为Homo sapiens，最小相互作用阈值设为highest confidence（＞0.9），获取蛋白质相互作用数据。将所得信息导入Cyto‐scape 3.7.2软件，利用内置工具Network analyzer进行分析，根据Degree＞10筛选核心靶点并绘制柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心靶点的可视化PPI网络。PPI网络中的网络节点代表靶点，边代表蛋白质相互作用关系，节点面积越大、颜色越红代表该靶点生物学重要性越强。

1.4 核心靶点的GO生物过程和KEGG通路富集分析 将获取的柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心靶点上传至生物学信息注释数据库DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）平台，物种设定为人，Select Identifier设定为OFFICIAL GENE SYMBOL，List Type设定为Gene List，对柴胡—石菖蒲抗抑郁靶点进行GO生物过程和KEGG通路富集分析，取P＜0.01且Count≥15的结果对柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的作用机制进行预测。

1.5 柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心成分分析 根据P＜0.01筛选KEGG通路富集分析中排名最前的20条通路，采用Cytoscape 3.7.2软件构建柴胡—石菖蒲活性成分—抑郁症靶点—信号通路可视化网络图，通过Cytoscape 3.7.2内置工具Network analyzer分析活性成分及靶点的网络拓扑参数，进一步明确柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的核心成分。网络图中圆形节点表示药物活性成分，菱形节点表示潜在核心靶点，倒三角形节点表示作用通路，边表示药物活性成分与潜在靶点以及潜在靶点与作用通路间的相互作用关系，节点面积越大表示该节点生物学重要性越强。

2 结果

2.1 柴胡—石菖蒲活性成分及作用靶点筛选结果 TCMSP中共收集柴胡活性成分349种、石菖蒲活性成分105种，符合OB≥30%且DL≥0.18的柴胡活性成分12种、石菖蒲活性成分4种。共收集275个柴胡成分作用靶点、68个石菖蒲成分作用靶点，删除柴胡、石菖蒲中重复的成分靶点后，再将两种药物成分靶点取交集，得到172个作用靶点。柴胡—石菖蒲中的主要活性成分为槲皮素、异鼠李素、山奈酚、豆甾醇、8-异戊烯基山奈酚等，见表1。柴胡—石菖蒲中发挥相对重要作用的靶点为原癌基因JUN、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、肿瘤蛋白p53（TP-53）等，见OSID码图1。

2.2 抑郁症靶点筛选结果 通过GeneCards数据库收集抑郁症相关靶点11 479个，经Score大于中位数筛选后获得靶点1 946个，合并OMIM数据库中抑郁症相关靶点并去重复后，共获得抑郁症靶点1 960个。

2.3 柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心靶点分析结果 将172个药物成分靶点与1 960个抑郁症相关靶点合并、取交集，得到98个柴胡—石菖蒲治疗抑郁症靶点。进一步筛选出柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核 心 靶 点21个，包 括AKT1、JUN、TNF、TP-53、MAPK1、白细胞介素6（IL-6）、MAPK8、表皮生长因子 受 体（EGFR）、MAPK14、c-fos原 癌 基 因 蛋 白（FOS）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、趋化因子8（CXCL8）、雌激素受体1（ESR1）、白细胞介素1B（IL-1B）、视网膜母细胞瘤蛋白1（RB1）、信号转导与转录激活因子1（STAT1）、半胱天冬酶8（CASP8）、IL-2、表皮生长因子（EGF）、CCL2、蛋白激酶Cβ（PRKCB）。见OSID码图2。

表1 柴胡—石菖蒲的主要活性成分

2.3 核心靶点的GO生物过程和KEGG通路富集分析结果 GO生物过程分析共得到生物过程470条，其中P＜0.01且Count≥15的生物过程共12条，分别为RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导、对药物的应答、DNA模板转录的正调控、凋亡过程、凋亡过程的负调控、细胞增殖的负调控、细胞增殖的正调控、炎症应答、衰老、血管再生、氧化还原过程。KEGG信号通路分析共获得信号通路123条，其中P＜0.01且Count≥15的信号通路共16条，包括肿瘤途径、乙型肝炎、TNF信号通路、恰加斯病、弓形体病、甲型流感、肺结核、缺氧诱导因子1信号通路、Toll样受体信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路、MAPK信号通路、癌症蛋白多糖、丙型肝炎、黏着斑、人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型感染、癌症微小RNAs。

2.4 柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心成分分析结果 柴胡—石菖蒲活性成分—抑郁症靶点—信号通路网络中共包括133个节点、528条边，见OSID码图3。柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的核心成分Degree值从高到低依次为槲皮素、8-异戊烯基山奈酚、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素。见表2。

表2 柴胡—石菖蒲治疗抑郁症核心成分网络参数分析结果

3 讨论

柴胡具有疏肝解郁之功，是治疗郁病的要药，在四逆散、逍遥散、柴胡疏肝散等许多理气剂中均有重要作用。石菖蒲豁痰开窍、醒神益智，对中枢神经系统疾病具有治疗作用［4］。柴胡—石菖蒲在临床治疗抑郁症中应用广泛。研究发现，将柴胡皂苷与石菖蒲提取液联合运用，可显著增强石菖蒲水提液和醇沉液治疗抑郁症的效果［5］。本研究通过分析柴胡—石菖蒲的活性成分及作用靶点发现，两种药物共有16种活性成分，172个作用靶点，槲皮素、8-异戊烯基山奈酚、山奈酚、豆甾醇、异鼠李素为柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的核心成分，其中山奈酚为柴胡—石菖蒲所共有的活性成分。研究显示，槲皮素可改善促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）诱导的大鼠焦虑、抑郁样行为［6］。炎症反应与抑郁症的发生密切相关，当核转录因子κB（NF-κB）通路过度激活时，可引起炎症反应并进一步影响情绪中枢，可能会导致抑郁样行为［7］。而8-异戊烯基山奈酚作为NF-κB通路的抑制剂，对由NF-κB调节的典型炎症基因表达具有负向调控作用［8］。研究发现，山奈酚能改善抑郁模型大鼠海马的损伤，并能减少海马神经元凋亡［9］。另有研究显示，在抑郁症的发病机制中，细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）和环磷腺苷反应元件结合蛋白（CREB）发挥重要作用［10］；而豆甾醇能显著提高海马ERK和CREB的表达水平，从而改善抑郁症状［11］。研究表明，异鼠李素可以降低前额叶皮质、海马胆碱酯酶及脑源性神经营养因子的活性，增强胆碱信号转导和突触可塑性，通过改善神经功能、增强认知和记忆从而预防和治疗神经退行性疾病［12］。

柴胡—石菖蒲治疗抑郁症靶点PPI网络显示，JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK1、IL-6等核心靶点在柴胡—石菖蒲对于抑郁症的治疗中具有相对重要的作用。相关文献显示，AKT1、MAPK1靶点可能是抗抑郁治疗的关键靶点［13-15］。研究发现，JUN与抑郁症关系密切，其可能是抗抑郁药物发挥作用的传导物质；此外，还发现其与抑郁症主要发病机制之一的神经再生有关［16］。遗传学研究发现，IL-6基因是抑郁障碍的重要易感基因，单相与双相抑郁发作患者的血清IL-6水平显著升高，并与其病情的严重程度一致［17-18］。

GO生物学过程富集分析显示，柴胡—石菖蒲治疗抑郁症主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导、DNA模板转录的正调控、凋亡过程等生物学过程。KEGG信号通路富集分析显示，PI3K-AKT、MAPK、Toll样受体信号通路等信号通路可能为柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的关键通路。PI3K-AKT信号通路在抑郁症的发病过程中具有重要作用，突触可塑性是抑郁症发病机制之一，PI3KAKT信号通路可通过影响突触可塑性缓解抑郁症状［19］。此外，抑郁患者海马损伤与海马神经细胞凋亡增加有关，而PI3K-AKT可通过抑制NF-κB信号通路抑制细胞凋亡，从而起到抗抑郁作用［20］。研究显示，MAPK信号通路可通过调控细胞增殖、分化及凋亡影响抑郁症的发生并参与抗抑郁药物的治疗机制［21］。目前已经证明的MAPK信号通路共有5条，其中与抑郁症关系最为密切的是ERK1/2信号通路，该信号通路为抗抑郁药物首要作用目标，也是参与细胞可塑性的重要途径［22］。神经发生是抑郁症发病机制之一。研究表明，通过调控细胞增殖、分化以及凋亡，Toll样受体信号通路可影响神经发生、轴突生长和结构重塑，从而起到抗抑郁作用［23］。

综上所述，本研究通过网络药理学对柴胡—石菖蒲治疗抑郁症的作用机制进行了初步探索，其中涉及了多种成分、靶点、生物过程及信号通路。柴胡—石菖蒲的活性成分可通过JUN、AKT1、TNF等核心靶点作用于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导等生物学过程及PI3K-AKT、MAPK等信号通路，协同发挥治疗抑郁症的作用。