miR-106a-5p靶向调控ERK2对胃癌细胞顺铂耐药性的影响及其分子机制

杨万荷，李家群，张东艳，王昌高，昝慧

1海南省人民医院，海口 570100；2海口市人民医院

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其早期症状不典型且复发率较高，导致许多患者的生存预后不佳［1］。化疗是胃癌综合治疗的重要部分，术后化疗有助于消灭局部微小转移灶，减少肿瘤局部复发。但部分患者术后化疗过程中出现对化疗药物耐药的现象，导致治疗效果不佳。细胞耐药与药物代谢异常、DNA修复功能增强及细胞增殖及凋亡相关基因表达异常相关，但具体机制尚不明确［2］。因此，有必要深入研究胃癌耐药发生的机制，寻找新的诊断治疗靶点。微小RNA106a-5p（miR-106a-5p）是miR-17家族成员之一，其在结直肠癌、肾细胞癌等多种肿瘤中异常表达，可影响转化生长因子β2受体等基因表达，从而调控肿瘤的发生发展过程［3-4］。细胞外信号调节激酶2（ERK2）属于MAP激酶家族成员，可参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等多种细胞过程。研究表明，ERK2在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中异常表达，并可促进肿瘤细胞的增殖及转移，与患者不良预后相关［5-6］。有学者发现，卵巢癌及甲状腺癌细胞中抑制miR-106a-5p表达后，ERK2表达显著上调，肿瘤细胞增殖及迁移能力增强且对化疗药物顺铂（DDP）的耐药性提高［7-8］。2018年10月—2020年1月，我们通过建立胃癌DDP耐药细胞株MGC-803/DDP，初步探讨miR-106a-5p靶向调控ERK2对胃癌DDP耐药性的影响并分析其可能机制，以期为临床胃癌化疗耐药患者的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料 胃癌细胞系MGC-803购自中国协和细胞库，DDP购自Hospira公司。主要试剂：RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶、4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液均购自北京索莱宝公司。Cyclin D1、Caspase3、ERK2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MDR1一抗均购自Abcam公司。二抗HRP-linked anti-rabbit IgGantibody购自Cell Signaling Technology公司。EdU增殖检测试剂盒及Hoechst33258染色试剂盒购自上海一研生物公司。Annexin-V试剂盒购自MultiSciences公司。PI购自PeproTech公司。FACSCalibur流式细胞仪购自BD Biosciences公司。Transwell细胞培养板购自Corning公司。Matrigel基质胶购自BD公司。RNeasy Plus Mini Kit购自Qiagen公司。SYBR®Green PCR Master Mix购自ABI公司。miRNA RT试剂盒购自海南基因公司。miR-106a-5p模拟物（miR-106a-5p mimic）、ERK2过表达质粒（pcDNA3.1-ERK2）、ERK2野生型质粒（ERK2-WT）、ERK2突变型质粒（ERK2-MUT）、对照质粒（NCmimic）均购自华大基因公司。

1.2 细胞培养及DDP耐药细胞株建立 将胃癌细胞系MGC-803置于含10%FBS的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2培养箱中培养。当MGC-803细胞生长至对数生长期时，将DDP由0.5 mg/L开始诱导，每48 h更换一次培养基。待细胞状态稳定，即达到对数生长期后，梯度增加25%的DDP浓度，直到细胞能够稳定存活于5 mg/L的DDP培养基中并能够连续传代培养，表明MGC-803/DDP耐药细胞株建立成功。

1.3 细胞miR-106a-5p、ERK2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取对数生长期的MGC-803及MGC-803/DDP细胞，以1×106/mL接种至6孔板，待细胞融合度达80%后按照Qiagen RNeasy Plus Mini Kit说明提取MGC-803及MGC-803/DDP细胞总RNA，使用miRNA RT试剂盒进行逆转录得到cDNA。使用SYBR®Green PCR Master Mix在Bio-Rad CFX 96 Touch实时PCR检测系统上进行RT-PCR分析。miR-106a-5p QRT-PCR参数设置：95℃10 s，95℃10 s，60℃30 s，在70℃延伸10 s，共40个循环；ERK2 QRT-PCR参数设置：95℃10 s，95℃40 s，60℃60 s，70℃10 s，共35个循环。引物序列：miR-106a-5p上游引物5′-GATGCTCAAAAAGTGCTTA‐CAGTGCA-3′、下 游 引 物5′-TATGGTTGTTCT‐GCTCTCT-3′，内参U6上游引物5"-CTCGCTTCG‐GCAGCACA-3、下 游 引 物5"-CCAGTGCAGGGTCC‐GAGGTAT-3"；ERK2上游引物5′-TGGATTCGACT‐TAGACTTGACCT-3′、下游引物5′-GGTGGGTTATG‐GTCTTCAAAAGG-3′，内 参β-actin上 游 引 物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′、下 游 引 物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。以U6、β-actin为内参，按照2－ΔΔCt计算miR-106a-5p及ERK2 mRNA的相对表达量。

1.4 miR-106a-5p与ERK2靶向调控关系分析 采用在线生物学信息学软件结合位点预测及荧光素酶报告基因实验。使用在线生物学信息学软件star‐Base（http：//starbase.sysu.edu.cn/）和Targetscan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）预测程序预测miR-106a-5p与ERK2是否存在结合位点；将MGC-803/DDP细胞以5×104/孔接种到24孔板中，接种12 h后随机分为4组，分别进行ERK2-WT、ERK2-MUT与miR-106a-5p mimic、NCmimic的共转染，室温孵育48 h后，使用双荧光素酶测定系统（Promega公司）和微板发光计（Berthold公司）测定荧光素酶活性。

1.5 细胞分组转染 将MGC-803/DDP细胞以1×106/mL铺至6孔板，分为mimic组（转染miR-106a-5p mimic）、ERK2组（转染pcDNA3.1-ERK2）、mimic+ERK2组（共转染miR-106a-5p mimic和pcDNA3.1-ERK2）、NC组（不转染），每组设3个复孔。采用LipofectamineTM3000转染试剂按照分组进行转染，转染48 h后收集4组细胞，参照“1.3”采用RT-PCR法检测miR-106a-5p、ERK2表达。结果显示，mimic组miR-106a-5p相对表达量（30.09±3.39）高于NC组（0.51±0.11），ERK2组ERK2相对表达量（10.23±1.58）高于NC组（3.10±0.36），mimic+ERK2组miR-106a-5p、ERK2相对表达量（27.13±3.14、6.12±1.29）均高于NC组（P均＜0.05），提示转染成功。

1.6 细胞增殖能力观察 采用EdU染色实验。收集“1.5”中转染48 h后的各组细胞，换液后加入20μmol/L的DDP，24 h后弃液，PBS清洗3次，各孔加入200μL EdU培养基（细胞培养基与EdU溶液按1 000∶1稀释），孵育2 h，弃培养基，PBS清洗细胞2次。各孔加入100μL细胞固定液（含4%多聚甲醛的PBS）室温孵育30 min，弃固定液；加入100μL 2 mg/mL甘氨酸，摇床孵育5 min；加入200μL PBS，摇床清洗5 min，弃液；加入200μL 1×Apollo®染色反应液，避光、室温、摇床孵育30 min；加入100μL渗透剂（0.5%TritonX-100的PBS），摇床清洗2～3次，每次10 min。DNA染色：各孔加入200μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、摇床孵育30 min，加入200μL PBS清洗3次。染色完成后立即进行荧光显微镜DNA复制活性检测，EdU阳性细胞数越多说明细胞增殖能力越强。

1.7 细胞凋亡水平观察 采用流式细胞术。收集“1.5”中各组细胞，在37℃下进行胰蛋白酶消化处理1 min；每组收集1×106～3×106个细胞，冷PBS清洗2次；4℃下离心5 min，重悬于500μL凋亡阳性对照缓冲液中，冰上孵育30 min；冷PBS清洗，去上清。加入适量预冷1×结合缓冲液重悬，加入数量相同且未经处理的肿瘤细胞与之混合。加入预冷1×结合缓冲液补充至1.5 mL，等分为3管（空白对照管1管、单染管2管）。单染管分别加入5μL Annexin VFITC及10μL PI，室温下避光孵育5 min。将5μL Annexin-V-FITC溶液加入细胞中，并在室温下避光孵育15 min。在流式细胞仪上用空白对照管调节FSC、SSC和荧光通道电压，进行流式分析，通过FITC检 测 通 道（Ex=488 nm；Em=530 nm）检 测Annexin-V-FITC，通过PI检测通道（Ex=535 nm；Em=615 nm）检测PI。使用流式细胞仪测定细胞凋亡，BDFACSCantoTM系统软件测定细胞凋亡数。

1.8 细胞侵袭能力观察 采用Transwell实验。制备基质胶铺板：将基质胶Matrigel用RPMI1640培养基以1∶8稀释，37℃下放置30 min使Matrigel聚合成凝胶；基底膜水化后，将Matrigel包被24孔板Tran‐swell小室底部膜的上室面。制备细胞悬液：胰酶消化细胞，含血清培养基终止消化后离心弃去培养液；用PBS清洗1～2遍，调整细胞密度至5×105/mL，用无血清培养基重悬。细胞接种：取100μL细胞悬液加入Transwell小室上室，下室加入600μL含20%FBS的培养基。放置细胞培养箱中培养24 h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS清洗2遍，甲醇固定30 min，将小室适当风干后用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS清洗3遍。400倍显微镜下随机5个视野观察细胞，采用镜下直接计数法计算膜下室侧贴壁细胞数，贴壁细胞数越多表示细胞侵袭能力越强。

1.9 细胞增殖凋亡、上皮间质转化相关蛋白及耐药基因检测 采用Western blotting法。将各组细胞以1×105/孔铺至6孔板，待细胞贴壁后加入20μmol/L DDP处理24 h；PBS清洗2遍，加入含蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA细胞裂解液进行裂解，提取细胞总蛋白。蛋白定量后，加入上样缓冲液，99℃水浴10 min后进行SDS-PAGE胶电泳（浓缩胶恒压80 V、分离胶恒压120 V、恒压80 V转印2 h）。将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中封闭2 h，加入增殖凋亡相关蛋白（Cyclin D1、Caspase3）、上皮间质转化相关蛋白（Ecadherin、N-cadherin、Vimentin）、耐药基因（MDR1）一抗（稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜；加入二抗（稀释比例1∶5 000），室温孵育1 h。采用ECL暗室显影照相，Image J软件分析条带灰度值，计算各蛋白相对表达量。

1.10 细胞DDP耐药性检测 采用MTT法。收集转染后的各组细胞，消化重悬后调整细胞密度为1×104/mL；接种至96孔板，加入细胞悬液100μL，置入细胞培养箱内培养24 h；分别加入浓度为40、20、2、0.2、0.02μg/mL的DDP，每个药物浓度设置3个复孔，同时设置不接种细胞的空白对照孔及不加药物的对照孔，放入细胞培养箱中培养2 d；加入20μL MTT，4 h后应用酶标仪检测570 nm处各孔光密度（OD）值，取各复孔OD值的平均值计算各浓度DDP对各组细胞生长的抑制率。抑制率=（对照孔OD值－实验孔OD值）/对照孔OD值×100%，根据抑制率计算各组细胞的半数抑制浓度（IC50）。IC50越低，说明细胞对DDP治疗越敏感，即耐药性越低。

1.11 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较行单因素方差分析，两组比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞中miR-106a-5p、ERK2 mRNA表达比较 MGC-803/DDP细胞中miR-106a-5p相对表达量低于MGC-803细胞，ERK2 mRNA相对表达量高于MGC-803细胞（P均＜0.05）。见表1。

2.2 miR-106a-5p与ERK2的调控关系 预测显示，ERK2基因序列445～452个碱基位置存在与miR-106a-5p的结合位点，见图1。共转染miR-106a-5p mimic+ERK2-WT或NCmimic+ERK2-WT的MGC-803/DDP细胞荧光素酶活性分别为1.91±0.29、3.39±0.51（P＜0.01），共 转 染miR-106a-5p mimic+ERK2-MUT或NCmimic+ERK2-MUT的MGC-803/DDP细胞荧光素酶活性分别为3.51±0.49、3.61±0.59（P＞0.05），提示miR-106a-5p可靶向负调控ERK2。

表1 MGC-803、MGC-803/DDP细胞中miR-106a-5p、ERK2 mRNA表达比较（-x±s）

图1 miR-106a-5p与ERK 2结合位点

2.3 各组细胞增殖、凋亡、侵袭能力比较 EdU阳性细胞数ERK2组＞NC组＞mimic+ERK2组＞mimic组，细胞凋亡数mimic组＞NC组＞mimic+ERK2组＞ERK2组，贴壁细胞数ERK2组＞NC组＞mimic+ERK2组＞mimic组（P均＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞Ed U阳性细胞数、细胞凋亡数、贴壁细胞数比较（个，-x±s）

2.4 各组细胞增殖凋亡、上皮间质转化相关蛋白及耐药基因表达比较 Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin、MDR1表达ERK2组＞mimic+ERK2组＞NC组＞mimic组，Caspase3、E-cadherin表 达mimic组＞mimic+ERK2组＞NC组＞ERK2组（P均＜0.05）。见表3。

2.5 各组细胞DDP耐药性比较 mimic组、ERK2组、mimic+ERK2组、NC组IC50分别为（1.51±0.08）、（7.58±0.14）、（3.67±0.12）、（4.46±0.11）μg/mL，ERK2组＞NC组＞mimic+ERK2组＞mimic组（P均＜0.05）。

3 讨论

我国胃癌发病率较高，胃癌的发病例数和死亡例数约占全球总病例数的50%［9］。以铂类为基础的化疗是晚期胃癌综合治疗的重要手段，但临床用药过程中存在耐药，甚至多药耐药，严重影响治疗效果。胃癌耐药机制的形成较为复杂，与DNA修复功能增强、药物靶点改变、幽门螺杆菌感染及细胞药泵效应或解毒效应增强有关［10］。因此，研究DDP耐药性的机制，寻找逆转DDP耐药性的方法，可能是提高DDP耐药的胃癌患者化疗疗效的关键。

表3 各组细胞增殖凋亡、上皮间质转化相关蛋白及耐药基因表达比较（-x±s）

ERK2是一种细胞外信号调节激酶，参与细胞增殖、分化和发育等生物学过程。研究显示，肿瘤中的ERK2能够被细胞膜相应受体如血管内皮生长因子受体、转化生长因子β受体过度磷酸化激活，由细胞质转位至细胞核，激活下游激酶，导致肿瘤细胞恶性增殖的同时产生对化疗药物的耐药性［11］。miR-106a-5p是miR-106a的剪切成熟体，其能够通过调控细胞表面Fas相关丝苏氨酸激酶的活性，影响下游ERK1/2的表达及活性，调控肿瘤细胞的增殖及凋亡［12］。有学者报道，鼻咽癌肿瘤细胞中miR-106a-5p表达水平升高能够通过下调ERK2信号传导通路的激活来逆转肿瘤细胞化疗耐药［13］。因此，miR-106a-5p可能通过直接下调ERK2表达逆转MGC-803/DDP细胞对DDP的耐药性。为验证该假设，我们首先检测了MGC-803及MGC-803/DDP中miR-106a-5p及ERK2 mRNA表达差异，发现MGC-803/DDP细胞中miR-106a-5p表达降低、ERK2 mRNA表达升高。通过生物信息学软件分析发现miR-106a-5p与ERK2 mRNA的3"UTR存在连续结合的位点，荧光素酶报告实验进一步确认miR-106a-5p能够靶向抑制ERK2 mRNA的表达。因此，我们推测miR-106a-5p/ERK2可能在MGC-803/DDP耐药细胞株中发挥重要的生物学功能。为进一步验证该假设，本研究通过在MGC-803/DDP细胞中转染ERK2过表达质粒或miR-106a-5p模拟物，观察其对细胞增殖凋亡及侵袭能力的影响。结果显示，miR-106a-5p mimic能够靶向ERK2降低DDP处理下MGC-803/DDP细胞的增殖及侵袭能力，提高细胞凋亡水平，提示miR-106a-5p能够通过靶向抑制ERK2表达逆转MGC-803/DDP细胞对DDP的耐药性。另外，miR-106a-5p亦可通过其他分子机制影响肿瘤细胞对DDP的耐药性。研究显示，抑制miR-106a表达能通过靶向上调多囊肾病基因2表达促进肿瘤细胞的凋亡，并导致肿瘤细胞G1/S期阻滞，增强非小细胞肺癌细胞对DDP的耐药性，而上调miR-106a后肿瘤细胞对DDP的敏感性升高［14］。

为进一步探讨miR-106a-5p通过ERK2逆转MGC-803/DDP细胞对DDP耐药性的具体机制，我们检测了各组MGC-803/DDP细胞增殖凋亡相关蛋白Cyclin D1、Caspase3的表达，结果显示，与ERK2组比较，mimic+ERK2组及mimic组Cyclin D1表达均较低，而Caspase3表达均较高；而mimic+ERK2组Cyclin D1表达较mimic组高，Caspase3表达较mimic组低。肿瘤的发生发展与细胞周期失控相关，细胞周期的进行依赖于一系列正负调节因子的作用，包括细胞周期素（如Cyclin D1等）和细胞周期素依赖激酶抑制蛋白。Cyclin D1可推动细胞周期由G1期进展到S期，而细胞周期素依赖激酶抑制蛋白可抑制细胞从G1期到S期过渡。有研究报道，结直肠癌细胞Cyclin D1表达增加可诱导肿瘤细胞的化疗耐药性，而抑制Cyclin D1表达能够增强化疗敏感性［15］。本研究结果亦提示，miR-106a-5p能够通过靶向抑制ERK2，导致Cyclin D1表达降低，从而抑制MGC-803/DDP细胞的增殖能力。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。本研究显示，miR-106a-5p能够增加Caspase-3的表达，进而促进MGC-803/DDP细胞凋亡。上皮间质转化是肿瘤细胞发生浸润转移的重要机制，主要表现为维持细胞之间黏附的上皮性表型如E-cadherin表达水平降低，而间质性表型如N-cadherin及Vimentin表达升高，导致细胞浸润转移能力增强［16］。研究显示，肿瘤细胞发生上皮间质转化与肿瘤化疗耐药性的产生密切相关，上皮间质转化相关信号通路的激活可参与肿瘤耐药性的形成，靶向上皮间质转化的治疗可能是克服肿瘤耐药的新思路［17］。此外，有学者在舌鳞癌的研究中发现，上皮间质转化过程中的关键转录因子Twist能够促进间质性标志物N-cadherin及Vimentin表达升高，并促进鳞癌细胞对DDP耐药性的形成［18］。有研究报道，ERK2是促进肿瘤细胞上皮间质转化过程的关键上游信号分子，并且是导致肿瘤细胞耐药的重要分子［19］。本研究结果显示，miR-106a-5p可通过靶向抑制ERK2活性导致E-cadherin表达降低，N-cadherin及Vimentin表达升高，从而抑制MGC-803/DDP细胞的侵袭能力。本研究对耐药基因MDR1水平的检测结果同样显示，miR-106a-5p可靶向ERK2使MDR1表达水平降低，进而逆转MGC-803/DDP细胞的耐药性。

综上所述，miR-106a-5p能够通过靶向抑制ERK2表达降低MGC-803/DDP细胞增殖、侵袭能力，增加MGC-803/DDP细胞凋亡水平并逆转其耐药性，该机制可能与改变增殖凋亡相关蛋白Cyclin D1和Caspase3表达、逆转上皮间质转化过程、降低耐药基因MDR1表达水平有关。